WWW.DOC.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные документы
 

«Рекомендуемые лабораторные тесты для выявления вируса птичьего гриппа А в образцах, взятых у людей Общая информация Высоко патогенный птичий ...»

Рекомендуемые лабораторные тесты для выявления

вируса птичьего гриппа А в образцах, взятых у людей

Общая информация

Высоко патогенный птичий грипп (ВППГ), вызываемый определенными

подтипами вируса гриппа А в популяциях животных, в частности, кур,

представляет постоянную угрозу для здоровья людей во всем мире. Прямое

инфицирование человека вирусом птичьего гриппа A(H5N1) было впервые

зарегистрировано во время вспышки болезни в Специальном административном

районе Китая Гонконг в 1997 г. Затем были зафиксированы случаи инфицирования людей штаммами птичьего гриппа подтипов H9 и H7. В связи с нынешней вспышкой птичьего гриппа A(H5N1) у людей и очевидной эндемичностью гриппа этого подтипа среди домашних птиц в южной Азии необходимо уделять повышенное внимание созданию потенциала для быстрой диагностики нетипичных инфекций гриппа. Для лабораторной идентификации вирусных инфекций гриппа А у людей обычно проводится прямое выявление антигенов, изолирование в клеточных культурах или выявление характерных для гриппа РНК с помощью реверсивной транскриптазы - полимеразной цепной реакции.

Эти рекомендации предназначены для лабораторий, получающих запросы на тестирование образцов, взятых у пациентов с заболеванием, похожим на грипп, в случаях, когда имеются клинические или эпидемиологические данные об инфекции гриппа А. Приведенные ниже лабораторные процедуры не содержат всей информации, необходимой для проведения тестов: для дополнительной информации обращайтесь к прилагаемому списку источников, технической рабочей группе 1 или Справочной лаборатории ВОЗ по гриппу H5 2.



Оптимальным образцом для выявления вируса гриппа А является носоглоточный аспират, взятый в течение трех дней с момента появления симптомов заболевания, однако можно также использовать носоглоточные мазки и другие образцы (http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/humanspecimens/en/index.ht ml).

В настоящее время создается техническая рабочая группа ВОЗ, первое совещание которой состоится в сентябре 2005 г.

Список Справочных лабораторий ВОЗ по гриппу H5 можно найти на:

http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/referencelabs/en/index.html Все действия с образцами и диагностическое тестирование необходимо выполнять при соблюдении стандартных руководящих принципов по биологической безопасности (http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/handlingspecimens/en/index.

html;

http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/WHO_CDS_CSR_LYO_2004_1 1/en/).

Стратегия первоначального лабораторного тестирования каждого образца заключается в быстрой диагностике вирусной инфекции гриппа А и исключении других распространенных вирусных респираторных инфекций. В идеале, результаты должны быть получены в течение 24 часов.

Методики диагностики гриппа

Существующие анализы для диагностики вирусных инфекций гриппа А включают:

1. Быстрое выявление антигенов. Результаты могут быть получены через 15-30 минут.

• Тесты на грипп, проводимые у постели пациента. Эти тесты имеются в продаже (Nicholson, Wood & Zambon, 2003).

• Реакция иммунофлюоресценции. Широко применяемый чувствительный метод диагностики вирусных инфекций гриппа А и В и пяти других клинически значимых респираторных вирусов (Lenette & Schmidt, 1979).

• Иммуноферментный анализ. Для выявления нуклеопротеина (НП) гриппа А.





2. Вирусная культура. Результаты готовы через 2-10 дней. Для выявления клинически значимых респираторных вирусов можно использовать как метод однослойных культур клеток, так и метод стандартных клеточных культур. В позитивных культурах гриппа может проявляться и не проявляться цитопатический эффект, но для идентификации вируса требуется проведение реакции иммунофлюоресценции клеточных культур или реакции торможения гемагглютинации (РТГА) среды клеточных культур (супернатанта).

3. Полимеразная цепная реакция и ПЦР в режиме реального времени. Все более широкое применение находят специальные мультипраймерные комплекты реагентов для выявления гена гемагглютинина (ГА) циркулирующих в настоящее время вирусов гриппа A/H1, A/H3 и B. Результаты могут быть получены в течение нескольких часов либо в клинических мазках, либо в инфицированных клеточных культурах. Кроме того, несколько Сотрудничающих центров ВОЗ разрабатывают реагенты для ПЦР и РТ-ПЦР для выявления нетипичных штаммов птичьего гриппа и гриппа человека (Fouchier et al., 2000; Lee & Suarez, 2004).

Рекомендуемые лабораторные тесты для выявления вируса птичьего гриппа А в образцах, взятых у людей 2 ВОЗ Женева, июнь 2005 г.

Любой образец с позитивным результатом, полученным при использовании вышеперечисленных методов для выявления вируса гриппа А, в котором подозревается инфекция птичьего гриппа, должен быть направлен на дальнейшее тестирование и проверку в назначенную ВОЗ Справочную лабораторию по гриппу H5 2.

Лаборатории, не обладающие потенциалом для проведения методик, необходимых для идентификации гриппа подтипа А, должны:

1. Направить образцы изолятов вирусов в Национальный центр по гриппу (http://www.who.int/csr/disease/influenza/centres/en/index.html) или в Справочную лабораторию ВОЗ по гриппу H5 2 для дальнейшей идентификации и характеристики.

2. Проинформировать страновое бюро ВОЗ или региональное бюро ВОЗ или Глобальную программу по гриппу в штаб-квартире ВОЗ (whoinfluenza@who.int) о том, что образцы изолятов вирусов направляются в другие лаборатории для дальнейшей идентификации или дальнейшей характеристики.

Идентификация птичьего гриппа подтипов А

–  –  –

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) может быть использована для выявления вируса как в клинических образцах, так и в клеточных культурах. Клинические образцы, полученные как можно скорее после появления симптомов заболевания, более предпочтительны, так как с развитием инфекции количество имеющихся инфицированных клеток уменьшается. Проведение РИФ на инокулированных клеточных культурах предпочтительнее, так как при этом происходит амплификация всех присутствующих вирусов.

Необходимые материалы

• Набор реагентов ВОЗ для гриппа для идентификации вируса гриппа A/H5 (версия 1997-98, 2003 или 2004 гг.). В этом наборе содержатся следующие реагенты для проведения реакции иммунофлюоресценции:

- пул моноклональных антител, специфичных для гриппа типа A/H5

- пулы моноклональных антител, специфичных для гриппа типа А и гриппа типа В

- моноклональные антитела, специфичные для гриппа подтипов A/H1 и A/H3

• Анти-мышь IgG FITC конъюгат

• Предметные стекла для микроскопа

• Покровные стекла, 24 х 60 мм

• Заливочная среда

• Ацетон

• Иммунофлюоресцентный микроскоп.

Рекомендуемые лабораторные тесты для выявления вируса птичьего гриппа А в образцах, взятых у людей 3 ВОЗ Женева, июнь 2005 г.

Методика Этот тест необходимо проводить в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к Набору реагентов ВОЗ для гриппа. Эпителиальные клетки освобождаются от слизи с помощью центрифугирования, фиксируются и окрашиваются специфичными моноклональными антителами. Инфицированные клетки эпителия дыхательных путей, содержащиеся в клинических образцах, очень лабильны и легко разрушаются; поэтому, во время исследования их следует держать в холоде на льду и не центрифугировать более чем при 500 г. Необходимо приложить контрольные стекла с клетками, инфицированными гриппом A/H3 и H1 (и, при наличии, клетками, инфицированными H5), и неинфицированными клетками в целях надлежащего контроля моноклональных антител и конъюгата и для интерпретации специфического окрашивания.

Интерпретация результатов

Специфическое окрашивание должно быть в виде интенсивной внутриклеточной флуоресценции светло-зеленого цвета. Может наблюдаться ядерная и/или цитоплазматическая флюоресценция. Важно обеспечить надлежащую плотность клеток. Одна или более целых клеток, в которых проявляется специфическая внутриклеточная флуоресценция, могут считаться позитивным результатом.

В связи с тем, что имеющиеся в продаже моноклональные антитела для выявления вирусов гриппа подтипов A/H1 вступают в перекрестную реакцию с вирусами гриппа подтипов A/H5, включая нынешние (2004 г.) штаммы, необходимо проведение подтверждающего тестирования с использованием моноклональных антител из набора ВОЗ.

Вирусная культура

Изолирование вирусов является чувствительной методикой, которая позволяет выделить вирус как для его идентификации, так и для его дальнейшей антигенной и генетической характеристики, тестирования на чувствительность к лекарствам и разработки вакцин. Предпочтительной клеточной линией для выращивания вирусных культур гриппа являются MDCK-клетки. Идентификация неизвестного вируса гриппа может быть осуществлена с помощью РИФ при использовании специфичных моноклональных антител (см. выше) или путем гемагглютинации (ГА) и антигенного анализа (установления подтипа) посредством реакции торможения гемагглютинации (РТГА) при использовании отобранных эталонных иммунных сывороток.

В отличие от других штаммов гриппа А вирус гриппа A/H5 можно культивировать на других общих клеточных линиях, таких как клетки Hep-2 и RD. При обращении с образцами и клеточными культурами, потенциально содержащими вирусы Рекомендуемые лабораторные тесты для выявления вируса птичьего гриппа А в образцах, взятых у людей 4 ВОЗ Женева, июнь 2005 г.

высоко патогенного птичьего гриппа А, необходимо соблюдать стандартные меры биологической безопасности.

ЗОЛОТОЕ ПРАВИЛО. Никогда нельзя обрабатывать в одной и той же лаборатории клинические образцы, взятые у людей, и клинические образцы, взятые у свиней или птиц.

Необходимые материалы

• Клетки Madin-Darby Canine Kidney (MDCK), ATCC CCL34

• Набор реагентов ВОЗ для гриппа для идентификации вируса гриппа A/H5.

Реагенты для идентификации вируса A/H5 в клеточной культуре включают:

- контрольный антиген гриппа A/H5: инактивированный

- вирус

- козья сыворотка анти-A/Tern/South Africa/61/H5

- куриная смешанная сыворотка анти-A/Goose/Hong Kong/437-4/99

• Набор реагентов ВОЗ для гриппа (распределяемый ежегодно)

- эталонные антигены A(H1N1) и A(H3N2) и эталонные иммунные сыворотки

• Энзим, разрушающий рецепторы (RDE)

• Красные кровяные клетки (курицы, индейки, человека с I группой крови, или морской свинки) в растворе Альсевера

Методика

1. Необходимо выполнять стандартные лабораторные процедуры по выращиванию клеточных культур для размножения клеточных культур, инокуляции образцов и сбора инфицированных клеток для РИФ или культурального супернатанта для ГА и РТГА (Lennette & Schmidt, 1979; ВОЗ, 2002 г.). При обращении с усиленными вирусами необходимо следовать стандартным руководящим принципам по соблюдению лабораторной биобезопасности (http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/handlingspecimens/en/in dex.html).

2. Необходимо выполнять стандартные процедуры ГА и РТГА, включая все рекомендуемые контрольные меры. Особая информация об эталонных сыворотках и антигенах содержится в Руководстве ВОЗ по диагностике и эпиднадзору гриппа у животных (ВОЗ, 2002 г.).

Интерпретация результатов Самый высокий титр вируса, вызывающий полную гемагглютинацию, считается конечной точкой титрации ГА. Конечной точкой РТГА является последнее разведение сыворотки, при котором происходит полное торможение гемагглютинации. Титр выражается величиной, обратной последнему разведению.

Рекомендуемые лабораторные тесты для выявления вируса птичьего гриппа А в образцах, взятых у людей 5 ВОЗ Женева, июнь 2005 г.

Идентификация полевого изолята осуществляется путем сравнения результатов неизвестного изолята с результатами контрольных антигенов. Изолят идентифицируется как вирус гриппа подтипа А, если характерный для подвида титр РТГА минимум в четыре раза превышает титр, полученный при использовании другой иммунной сыворотки.

Неспецифичные агглютинины могут присутствовать в сыворотках и приводить к ложно-негативным реакциям; и наоборот, некоторые изоляты могут быть крайне чувствительными к неспецифичным ингибиторам в сыворотках, что может приводить к ложно-позитивным реакциям.

Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является эффективной методикой идентификации геномов вируса гриппа. Геном вируса гриппа представляет собой одноцепочечную РНК, а для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) необходимо, прежде всего, использовать реверсивную транскриптазу (РТ). Для проведения амплификации РНК-генома (РТ-ПЦР) необходима пара олигонуклеотидных праймеров. Такие пары праймеров, в основу которых положена известная последовательность ГА вируса птичьего гриппа подтипов А и N1, будут приводить к амплификации РНК только одного подтипа. Возможно дальнейшее исследование ДНК, образованных с использованием праймеров для определенных подтипов, с помощью молекулярно-генетических методов, таких как секвенирование.

Перечисленные ниже праймеры рекомендованы Сетью справочных лабораторий ВОЗ по гриппу H5 2. Создается техническая рабочая группа ВОЗ для своевременного обновления и разработки праймеров 1.

Необходимые материалы

• Мини набор QUIamp Viral RNA или аналогичный набор для выделения РНК

• Набор QUIGEN OneStep RT-PCR

• Ингибитор RNase (ABI) 20U/µl

• Стерильные пробирки для микроцентрифуги, 0,2, 0,5 и 1,5 мл

• Наборы праймеров Праймеры гена ГА для амплификации H5 (модифицированные в соответствии с Yuen et al. 1998):

H5-1: GCC ATT CCA CAA CAT ACA CCC H5-3: CTC CCC TGC TCA TTG CTA TG Предполагаемый размер продукта: 219 п.о.

–  –  –

Праймеры гена НА для амплификации N1 (Wright et al. 1995):

Рекомендуемые лабораторные тесты для выявления вируса птичьего гриппа А в образцах, взятых у людей 6 ВОЗ Женева, июнь 2005 г.

N1-1: TTG CTT GGT CGG CAA GTG C N1-2: CCA GTC CAC CCA TTT GGA TCC Предполагаемый размер продукта: 616 п.о.

• Подтверждающий контроль (предоставляется по запросу Справочной лабораторией ВОЗ по гриппу H5 2)

• Регулируемые пипетки, 10, 20 и 100 µl

• Одноразовые фильтры

• Микроцентрифуга, регулируемая на 13 000 об/мин

• Вихревой смеситель

• Термоциклер

• Поддон с агарозным гелем, камера для электрофореза и источник питания

• Ящик с УФ-облучателем или переносная УФ-лампа (302 нм) Методика

1. Выделить вирусную РНК из клинического образца с помощью мини набора QIAamp viral RNA или аналогичного набора для выделения РНК в соответствии с инструкциями производителя.

2. Одношаговая РТ-ПЦР

–  –  –

Рекомендуемые лабораторные тесты для выявления вируса птичьего гриппа А в образцах, взятых у людей 7 ВОЗ Женева, июнь 2005 г.

Добавить 5 µl вирусной РНК

–  –  –

4. Электрофорез продукта ПЦР в агарозном геле.

5. Подготовить агарозный гель, загрузить продукты ПЦР и маркер молекулярного веса и действовать в соответствии со стандартными протоколами. Наблюдать за полосками маркера и продукта ПЦР в УФ-свете.

Интерпретация результатов Предполагаемый размер продуктов ПЦР для гриппа A/H5 - 219 п.о., для A/H9 - 383 п.о. и для N1 - 616 п.о. Если тест проводится без положительного контроля, продукты необходимо подтвердить путем секвенирования и сравнения с последовательностями, хранящимися в базах данных. Отсутствие правильных продуктов ПЦР (то есть негативный результат) не исключает наличие вируса гриппа. Результаты необходимо интерпретировать с учетом имеющейся клинической и эпидемиологической информации. Образцы, взятые у пациентов с высокой вероятностью инфекции гриппа A/H5 или H9, должны быть протестированы другими методами (РИФ, выращиванием вирусных культур или серологическими исследованиями) для исключения инфекции гриппа A (A/H5 или H9).

Лабораторное подтверждение

Все лабораторные результаты по гриппу A/H5, H7 или H9, полученные в течение периода между пандемиями и периода готовности к пандемии в рамках Глобального плана ВОЗ по обеспечению готовности к пандемии гриппа (http://www.euro.who.int/document/CDS_CSR_GIP_2005.5R.pdf), должны быть подтверждены в Справочной лаборатории ВОЗ по гриппу H5 2 или в рекомендуемой ВОЗ лаборатории. Материалы, позитивные на инфекцию гриппа A/H5, H7 или H9, включая взятые у людей образцы, экстракты РНК из образцов, взятых у людей, и вирусы гриппа A/H5, H7 или H9, содержащиеся в жидкостях клеточных культур и аллантоисных жидкостях яиц, необходимо направлять в Рекомендуемые лабораторные тесты для выявления вируса птичьего гриппа А в образцах, взятых у людей 8 ВОЗ Женева, июнь 2005 г.

Справочную лабораторию ВОЗ по гриппу H5 2 или рекомендуемую ВОЗ лабораторию. Передача и публикация информации о результатах анализов должны осуществляться в соответствии с Руководством ВОЗ по своевременному обмену вирусами гриппа/образцами, способными вызвать пандемии гриппа человека (http://www.who.csr/disease/avian_influenza/guidelines/Guidance_sharing_viruses_speci mens/en/index.html).

Серологическая идентификация инфекции гриппа A/H5

Существующие на сегодняшний день тесты для измерения антител, специфичных для гриппа А, включают реакцию торможения гемагглютинации, иммуноферментный анализ и тест вирус-нейтрализации. Рекомендуемым тестом для измерения антител, специфичных для высоко патогенного птичьего гриппа А, является реакция микронейтрализации. В связи с тем, что для этого теста необходимы живые вирусы, его можно проводить только в лабораториях третьего уровня биологической безопасности.

Источники

- Fouchier RA et al. (2000). Detection of influenza A viruses from different species by PCR amplification of conserved sequences in the matrix gene. Journal of Clinical Microbiology, 38:4096-4101.

- Lee CW, Suarez DL (2004). Application of real-time RT-PCR for the quantitation and competitive replication study of H5 and H7 subtype avian influenza virus.

Journal of Virological Methods, 119:151-158.

- Lennette EH, Schmidt NJ, eds (1979). Diagnostic procedures for viral, rickettsial and chlamydial infections, 5th ed. Washington, DC, American Public Health Association.

- Nicholson KG, Wood JM, Zambon M (2003). Influenza. Lancet, 362:1733-1745.

- Spackman et al. (2002). Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. Journal of Clinical Microbiology, 40:3256-3260.

- WHO (2002). WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance. Geneva, World Health Organization (document WHO/CDS/CSR/NCS/2002.5, доступен на http://www.who.int/csr/resources/publications/influenza/en/whocdscsrncs20025rev.p df

- Wright KE et al. (1995). Typing and subtyping of influenza viruses in clinical samples by PCR. Journal of Clinical Microbiology, 33:1180-1184.

- Yuen KY et al. (1998). Clinical features and rapid viral diagnosis of human disease associated with avian influenza A H5N1 virus. Lancet, 351:467-471.

Рекомендуемые лабораторные тесты для выявления вируса птичьего гриппа А в образцах, взятых у людей 9

Похожие работы:

«Приложение № 1 к Правилам пользования парковками ПУБЛИЧНЫЙ ДОГОВОР (ОФЕРТА) о предоставлении услуг парковки Общество с ограниченной ответственностью "АПС-Мастер" (ООО "АПСМастер"), зарегистрированное в соответствии с законодательством Российской Федерации (ОГРН 1047796...»

«УТВЕРЖДЕНО Председатель Территориальной экзаменационной комиссии в Республике Татарстан (г. Казань) М. И. Юнусов ПРОТОКОЛ заседания Территориальной экзаменационной комиссии по проверке и оценке необходимых знаний водителей автотранспортных средств, перевозящих опасные грузы в Республике Татарстан (г. Ка...»

«Пудога. Конашков Ф.А. Илья Муромец. № 77. ИЛЬЯ МУРОМЕЦ А не волна ли с волной сволноваласе, А не волна—то — ведь Клин—царь, А сволновалсе—то со татарами; А ведь собрал тут тотары неверныих. 5. — "Ай же ты, тотарин со то...»

«ISSN 2313-2248 ПУТИ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ОРОШАЕМОГО ЗЕМЛЕДЕЛИЯ Научно-практический журнал Выпуск № 1(65)/2017 Новочеркасск Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "РОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПРОБЛЕМ МЕЛИОРАЦИИ" (ФГБНУ "РосНИИПМ") В...»

«Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАРОДНОГО ХОЗЯЙСТВА И ГОСУДАРСТВЕННОЙ СЛУЖБЫ ПРИ ПРЕЗИДЕНТЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ" СЕВЕРО-ЗАПАДНЫЙ ИНСТИТУТ УПРАВЛЕНИЯ ISSN 2303-9493 НАУЧНЫЕ ТРУДЫ Северо-Западного института управления РАНХиГС Том 6 Выпу...»

«Александр Юренко Никита Шаповал: мировоззренческие основы социологической теории От редакции. Публикуем фрагменты из книги: Шаповал М. Система суспіль них наук і соціографія (народознавство). —...»

«Административный регламент предоставления муниципальной услуги "Выдача выписок из похозяйственных книг" Раздел 1. Общие положения. Общие сведения о муниципальной услуге.1.1. Настоящий административный регламент предоставления...»

«Федеральное агентство по образованию Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Владимирский государственный университет Е.И. АРИНИН, Т.В. АНДРЯКОВА, Н.М. МАРКОВА ДИАЛОГ РЕЛИГИОЗНЫХ И НЕРЕЛИГИОЗНЫХ МИРОВОЗЗРЕНИЙ Курс лекций Владимир 2008 УДК 2(082.1) ББК 86я43 А81 Рецензенты: Доктор философских н...»

«Биоэтика личности Мария Аддолората Манджионе Введение В создании модели субъективизма, онтологически обоснованного, первостепенной необходимостью являлось нахождение объективного фундамента для этичного суждения, способным начертать и поддерживать...»

«К И И Ж Н А Я П О Л К А МАССОВО-ПОЛИТИЧЕСКАЯ ЛИТЕРАТУРА Животноводство края на подъеме. Из опыта работы передовиков животноводства, участников краевого совещания. Крайиздат, 1948 г., 76 стр., тираж 5000 экз., цена 3 рубля. В сборнике помещена статья секретаря Крайкома ВКП(б) Н. Пашкина "Край высокопродукти...»








 
2017 www.doc.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные документы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.