WWW.DOC.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные документы
 

«Введение. Микротрубочки играют принци УДК 577.212:004 С.А. БРЯНЦЕВА, Е.С. ГАВРЮШИНА, пиально важную роль в функционировании как животных, так и растительных клеток. Они А.И. ЕМЕЦ 3, П.А. КАРПОВ ...»

Введение. Микротрубочки играют принци

УДК 577.212:004

С.А. БРЯНЦЕВА, Е.С. ГАВРЮШИНА, пиально важную роль в функционировании

как животных, так и растительных клеток. Они

А.И. ЕМЕЦ 3, П.А. КАРПОВ 3, Я.Б. БЛЮМ 3,

необходимы для осуществления митоза и мейо

Ю.Ф. ДРЫГИН 1, Е.С. НАДЕЖДИНА 2

за, для обеспечения внутриклеточного транс

Московский государственный университет

порта и позиционирования органелл, а также

им. М.В. Ломоносова, Москва

играют существенную роль в поддержании фор Институт белка РАН, Москва мы клеток. В цитоплазме микротрубочки рас Институт пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины, Киев положены неслучайно: они образуют системы, MAST2 ПОДОБНАЯ ПРОТЕИНКИНАЗА выглядящие как сети или пучки. Эти системы ИЗ ВИНОГРАДА VITIS VINIFERA: могут быть плотными, правильно организован ными подобно веретену деления или достаточ КЛОНИРОВАНИЕ кДНК, но рыхлыми, как в большинстве интерфазных КОДИРУЮЩЕЙ КАТАЛИТИЧЕСКИЙ животных клеток [1]. В растительных клетках микротрубочки обычно расположены регуляр ДОМЕН но: они ориентируются относительно длинной оси клеток [2]. Нарушение системы микро трубочек влияет на клеточную морфологию [3].

Для функционирования системы микротрубо чек важна как структура их сети, так и динамика отдельных микротрубочек, составляющих сеть.

Микротрубочки – очень динамичные структу ры, их сети легко перестраиваются в ответ на различные воздействия на клетки [4]. Дина

–  –  –

ли реакцию с 2 мкл библиотеки кДНК вино града и первой парой праймеров, 1 цикл: 94 °С 30 с, 49 °С 30 с, 2–40 циклов, 72 °С 80 с. Затем брали 2 мкл смеси из этой реакции и ставили новый ПЦР со второй парой праймеров в тех же условиях, но проводили 30 циклов ампли фикации.

Секвенирование ДНК осуществляли с по мощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим ана лизом продуктов реакции на автоматическом Рис. 1. Электрофорез в 1% секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 Applied ной агарозе с 0,5 мкг/мл Biosystems в Межинститутском Центре кол бромистого этидия в ТВЕ лективного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН системе: 1 – суммарная (http://www.genome centre.narod.ru/), органи РНК клеток асцитной кар зованном при поддержке РФФИ. циномы Кребс II (3 мкг); 2 – Клонирование кДНК и ее экспрессия в культи суммарная РНК из листьев вируемых животных клетках. Полученную спе винограда (1 мкг). Обозна чена рибосомная РНК цифическую кДНК (ПЦР продукт) встраивали в вектор pEGFP C1 («Clontech», США) по сай там EcoRI/KpnI. Использовали рестриктазы и GMLK, клонировать ее в векторе для эксп лигазу фирмы «Fermentas» (Литва). Полученную рессии в животных клетках и, трансфициро плазмиду pEGFP MAST2HP наращивали в Es вав животные клетки, проверить, способен ли cherichia coli (штамм DH 5), очищали с помо белок синтезироваться в растворенном виде и щью набора QIAprep Spin MiniPrep («Qiagen», не токсичен ли он для клеток. При осуществле Германия) по инструкции производителя. нии этого плана для начала была предпринята Клетки Vero (клетки почки зеленой мар попытка выделения РНК из листьев винограда тышки) культивировали в среде DMEM/F12 с помощью набора RNeasy Plant Mini Kit («Qia («PanEco», Россия) с добавлением 10 % эмбрио gen», Германия). Эта попытка оказалась безус нальной телячьей сыворотки. Для трансфек пешной – выход РНК был очень небольшим ции использовали реагент Lipofectamin 2000 (менее 5 нг/ мкл), и рибосомную РНК не было («Invitrogen», США).

Через 20 ч после трансфек видно на электрофорезе. Впрочем, подобные ции клетки фиксировали 4% ным формальде результаты были получены с тканями вино гидом и проводили иммуноокрашивание града при применении набора RNeasy Plant микротрубочек с помощью моноклональных и другими авторами [29, 30]. Поэтому нами антител DM 1a к тубулину («Sigma Aldrich», было решено использовать другие методы вы США) и козьих антител к иммуноглобулинам деления РНК, в частности метод, изложенный мыши, конъюгированных с родамином («Jack в работе Moser et al. [29], с внесением некото son Immunoresearch», США). Препарат про рых модификаций. Выделение РНК согласно сматривали в микроскопе Axiovert 2000M протоколу, описанному в «Материалах и ме («Carl Zeiss», Германия) и фотографировали тодах», позволило получить около 10 мкг РНК с помощью цифровой видеокамеры AxioCam в конечном препарате из 400 мг ткани, причем HRc («Carl Zeiss»), управляемой программой РНК в процессе выделения избавлялась от за AxioVision 3.1 («Carl Zeiss Vision»). грязняющих ее пигментов. Судя по результатам Результаты исследований и их обсуждение. электрофореза, РНК имела удовлетворитель Для клонирования кДНК белка GMLK ное качество, несмотря на некоторую степень (A7NTE9_VITVI) нами было решено выделить деградации 25S рибосомной РНК (рис. 1).

РНК из листьев винограда, изготовить библио Выделенный препарат РНК листьев вино теку кДНК, с помощью ПЦР амплифицировать града использовали для получения библиоте специфическую кДНК, кодирующую белок ки кДНК. Для этого проводили реакцию с об ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 4 С.А. Брянцева, Е.С. Гаврюшина, А.И. Емец, П.А. Карпов, Я.Б. Блюм, Ю.Ф. Дрыгин, Е.С. Надеждина Рис. 2. Выравнивание аминокислотных последовательностей клонированного белка MAST2HP и белка GMLK (A7NTE9) (а), а также протеинкиназы MAST2 человека HuMAST2 (фрагмент) (б). Выравнивание выполнено с помощью NCBI BLAST 2 сервиса c помощью программ [20]

–  –  –

ратной транскриптазой SuperScript, как описа но в «Материалах и методах». По нашему пре дыдущему опыту, SuperScript дает гораздо луч шие результаты при получении библиотек кДНК, чем другие обратные транскриптазы.

Для изолирования специфической кДНК использовали ранее созданную библиотеку кДНК. После проведения первого раунда ПЦР (40 циклов с первой парой праймеров) ПЦР продукт получался несколько гетерогенным.

Поэтому использовали еще 30 циклов ПЦР со второй парой праймеров, что привело к полу чению четкой полосы ПЦР продукта при его анализе в агарозном электрофорезе (данные не представлены). Результаты секвенирования ПЦР продукта показали его однородность и соответствие целевому белку GMLK. После встраивания в вектор было проведено полное секвенирование встройки по обеим цепям ДНК, и его результаты подтвердили правиль ность встройки кДНК в вектор, а также нали чие открытой рамки считывания по всей дли не встройки, со стоп кодоном в ее конце.

Клонированная нами кДНК и предсказы ваемый кодируемый белок (MAST2 homologous protein – MAST2HP) практически полностью совпадали по первичной структуре с белком GMLK (A7NTE9_VITVI) и кодирующей его кДНК (рис. 2). Нами было обнаружено семь то чечных замен нуклеотидов, приводящих к четырем точечным заменам аминокислот. Эти расхождения могут быть следствием исполь зования разных сортов винограда при клони ровании GMLK и MAST2HP или же могут Рис. 3. Микротрубочки в культивируемых клетках Vero, быть вызваны ошибками ПЦР при получении экспрессирующих pEGFP MAST2HP: а – пара клеток обоих образцов. Расхождения не затронули после деления, б – перестройка системы микротрубо чек (стрелка), в – изменение формы клетки (отростки функционально важных участков каталити показаны стрелками). Слева – вид клеток во флюо ческого киназного домена, входящего в состав ресцентном канале для GFP, справа – вид клеток во MAST2HP.

флюоресцентном канале для родамина. Масштабная Нами была также проведена экспрессия по линейка – 20 мкм лученного конструкта в гетерологичной сис теме: в культивируемых клетках Vero (рис. 3). точными тельцами (рис. 3, а). Система мик Продукт экспрессии, выявляемый по свечению ротрубочек чаще всего не отличалась от конт зеленого флюоресцентного белка, достаточно роля, однако иногда отмечали ее коллапс равномерно распределялся по цитоплазме и с образованием пучков микротрубочек (рис. 3, ядру клеток, отмечались лишь небольшие б). Нередко наблюдали изменение формы кле тельца включения. Клетки, экспрессирующие ток – клетки образовывали длинные выросты конструкт, в своем большинстве не утрачива (рис. 3, в). Таким образом, белок MAST2HP ли жизнеспособности, они делились, что было не является высокотоксичным для клеток, эк видно по наличию пар клеток, связанных оста спрессируется в растворенной форме даже в ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 4 С.А. Брянцева, Е.С. Гаврюшина, А.И. Емец, П.А. Карпов, Я.Б. Блюм, Ю.Ф. Дрыгин, Е.С. Надеждина

–  –  –



Похожие работы:

«УДК 81’37 Е. В. Васильева Иркутский государственный университет Словообразовательный потенциал многозначных прилагательных в сфере производства имен лиц Статья посвящена описанию словообразующих...»

«ПАСТАЎСКІ РАЁННЫ ПОСТАВСКИЙ РАЙОННЫЙ ВЫКАНАЎЧЫ КАМІТЭТ ИСПОЛНИТЕЛЬНЫЙ КОМИТЕТ (Пастаўскі райвыканкам) (Поставский райисполком) РАШЭННЕ РЕШЕНИЕ 5 лютага 2014 г. № 117 г. Паставы г. Поставы Об образовании участковых избирательных комиссий по выборам депутатов местных Советов депутатов Республики Беларусь двадцать...»

«СУЩНОСТНЫЕ НАСТАВЛЕНИЯ ДЛЯ МЕДИТАЦИИ. КАРМА. ЛЕКЦИЯ 12 Я очень рад вас увидеть вновь. Как обычно, вначале я дам вам небольшой совет. Если вы являетесь буддистами и интересуетесь буддистской практикой, то это очень хорошо. Но знать лишь теорию недостаточно. Теория подобна лекарств...»

«География. 8 класс. Демонстрационный вариант № 1 (90 минут) 1 Диагностическая тематическая работа № 1 по подготовке к ОГЭ по ГЕОГРАФИИ по теме "Географическое пространство России" (программа "Геог...»

«Они имели следующие подразделения: Гораз (Гуроз), Ярбек, Анна-бай и Дж амчи. Среди этой группы 'были крупные баи-овцеводы (особенно бы­ ли известны баи подразделения Г ораз). Во время басмачества баи отко­ чевали в Афганистан, уведя с собой мн...»

«Обобщение практики рассмотрения споров, связанных с обеспечительными мерами 1. Обязанность доказывания необходимости принятия мер по обеспечению иска лежит на лице, ходатайствующем о принятии таких мер. Истец одновременно с подачей искового заявления о взыскании с от...»

«27 РЕГИОН МЧС Более 50 государств мира решили объединиться для создания в своих странах зон безопасности, 20 стран ВЫПУСК 3 присоединились к ним в качестве наблюдателей. Как результат совместных усилий, 1 марта 1972 года была учреждена Международная организация гражданской...»

«Промысловые природные ресурсы в Арктических улусах Якутии. Соловьев Ф.П., Соловьев Т.П., Филиппов А.Н. Технологический институт СВФУ им.М.К.Аммосова Якутск, Россия В современном геополитическом балансе прир...»

















 
2017 www.doc.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные документы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.