WWW.DOC.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные документы
 

Pages:   || 2 |

«РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ (19) (11) (13) RU 2 537 139 C2 (51) МПК A61K 9/14 (2006.01) A61K 39/395 (2006.01) A61K 47/26 (2006.01) ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ...»

-- [ Страница 1 ] --

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ (19) (11) (13)

RU 2 537 139 C2

(51) МПК

A61K 9/14 (2006.01)

A61K 39/395 (2006.01)

A61K 47/26 (2006.01)

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА

ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

2010133997/15, 14.01.2009

(21)(22) Заявка: (72) Автор(ы):

АДЛЕР Михель (DE), (24) Дата начала отсчета срока действия патента:

КРАУЗЕ Ханс-Юрген (DE), 14.01.2009 ЗИДЛЕР Михель (DE), ЛАССНЕР Петер (DE),

Приоритет(ы):

ЛИ Джеффри (DE) (30) Конвенционный приоритет:

RU 15.01.2008 US 61/021,298 (73) Патентообладатель(и):

ЭББОТТ ГМБХ УНД КО.КГ (DE) (43) Дата публикации заявки: 27.02.2012 Бюл. № 6 (45) Опубликовано: 27.12.2014 Бюл. № 36 (56) Список документов, цитированных в отчете о поиске: US 2004/0191243 A1, 30.09.2004. US 2005/0250704 A1, 10.11.2005. Holler E., et al., Modulation of acute graft-versus-host-disease after allogeneic bone marrow transplantation by tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) release in the course of pretransplant conditioning: role of conditioning regimens and prophylactic application of a monoclonal (см.

прод.) C2 C2 (85) Дата начала рассмотрения заявки PCT на национальной фазе: 16.08.2010 (86) Заявка PCT:

EP 2009/050385 (14.01.2009) (87) Публикация заявки PCT:



WO 2009/090189 (23.07.2009)

Адрес для переписки:

129090, Москва, ул. Б.Спасская, 25, стр.3, ООО

–  –  –

(56) (продолжение):

antibody neutralizing human TNF alpha (MAK 195F). Blood. 1995 Aug 1;86(3):890-9. Burmester GR., et al., Adalimumab alone and in combination with disease-modifying antirheumatic drugs for the treatment of rheumatoid arthritis in clinical practice: the Research in Active Rheumatoid Arthritis (ReAct) trial. Ann Rheum Dis. 2007 Jun;66(6):732-9. Epub 2007 Feb 28. Peng Y., et al., [Chemical synthesis of biodegradable poly-para-dioxanone and its application for mandibular fracture fixation]. [Article in Chinese] Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 2003 Dec;21(6):425-7, 431. Raiche AT., et al., Modulated release of bioactive protein from multilayered blended PLGA coatings. Int J Pharm. 2006 Mar 27;311 (1-2):40-9. Epub 2006 Jan 24. RU 2 200 002 C1, 10.03.2003. US 2003/0064105 A1, 3.04.2003

–  –  –

SUBSTANCE: group of inventions refers to fragment, and an excipient, wherein the composition medicine and concerns a method for preparing a spray- contains residual moisture of 6% or less and the dried stable powder composition containing an antibody antibody or its antigen-binding fragment is specified in or its antigen-binding fragment; a pharmaceutical a group consisting of MAK 195F, ABT-325, ABT-308 preparation containing an effective amount of the spray- or ABT-147.

dried stable powder composition containing the EFFECT: group of inventions provides preparing antibody or its antigen-binding fragment and prepared the spray-dried high-stability powder composition.

by the method described above; the spray-dried stable 44 cl, 11 dwg, 14 tbl powder composition prepared by the method described RU

Стр.: 3 RU 2 537 139 C2

Родственные заявки По данной заявке испрашивается приоритет по предварительной патентной заявке США номер 61/021298, поданной 15 января 2008 г., полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.

Уровень техники изобретения Основным принципом фармацевтических белковых препаратов является то, что должна быть преодолена определенная нестабильность. Пути деградации белков можно разделить на два типа, включающих химическую нестабильность и физическую нестабильность. Химическая нестабильность приводит к изменению белка за счет образования связей или расщепления. Примеры проблем, связанных с химической нестабильностью, включают дезамидирование, рацемизацию, гидролиз, окисление, бета-элиминирование и дисульфидный обмен. Физическая нестабильность, с другой стороны, не приводит к ковалентным изменениям в белках. Скорее, она связана с изменениями в структуре высшего порядка (вторичная и выше) белков. К ним относятся денатурация, адсорбция на поверхности, агрегация и преципитация. Manning et al., Pharm.

Res. 6, 903 (1989).

После открытия структуры ДНК Уотсоном и Криком (1953) и последующего завершения проекта секвенирования человеческого генома интерес к химии белка рос быстрыми темпами. Отношения между генами и их белковыми продуктами при заболеваниях, в тканях и при развитии вызывали особый интерес. Next generation pharmaceutical, выпуск 6 (GDS publishing Ltd., 2006). За прошедшие десятилетия количество фармацевтических препаратов на основе белков увеличивалось очень быстро. В настоящее время некоторые белки или пептиды можно выделять или синтезировать, модифицировать и доставлять для ослабления или исцеления определенных нарушений и заболеваний. Основным способом применения фармацевтических препаратов на основе белков по-прежнему является внутривенное введение жидких препаратов, однако протестированы и применяются также и другие способы.

Было предпринято много усилий для перевода белковых растворов в твердые формы.

Порошковые композиции имеют много преимуществ, например, большие количества белка можно хранить или транспортировать, так как они занимают меньше места и имеют меньший вес, и при этом расходуется энергии меньше, чем требуется для охлаждения жидких препаратов во время хранения и доставки. Порошковые композиции также легче использовать в новых способах доставки, таких как ингаляция (Tzannis et al., международная публикация № WO 2005067898) или безыгольная инъекция (Burkoth, The Drug Delivery Companies Report 76-78 (2001)). Для получения порошков из водных растворов белков используют различные методы, среди них распылительная сушка, распылительная сублимационная сушка, сублимационная сушка или осаждение из сверхкритических жидкостей, либо (частично) органических растворов. Winters et al., Journal of Pharm. Sci. 85(6): 586-594 (1996). В отличие от сублимационной сушки, которая является очень дорогой и трудоемкой процедурой, распылительная сушка является эффективным, действенным способом получения нагруженных белком сухих веществ, которые предоставляют возможности для разработки новых форм доставки биофармацевтических препаратов, таких как ингаляция. Maa et al., Pharm. Res.

16(2):

249-254 (1999).

При распылительной сушке чистого белкового раствора существует риск возникновения частичной инактивации, которая автоматически приводит к снижению качества фармацевтических препаратов. Инактивация, например, может быть вызвана процессом, связанным с физическим стрессом из-за высоких температур, напряжения

Стр.: 4 RU 2 537 139 C2

сдвига и больших поверхностей раздела фаз (жидкость/газ), такая как денатурация или агрегация, либо химическими реакциями, например, гидролизом или окислением.

Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к способам распылительной сушки белковых препаратов, содержащих белок и эксципиент. В частности, способы и композиции по изобретению основаны на методе распылительной сушки, в котором раствор, содержащий интересующий белок и эксципиент, сушат распылением.

Препарат по изобретению обладает многими преимуществами по сравнению со стандартными растворами и лиофилизированными препаратами. В частности, способы распылительной сушки по изобретению сводят к минимуму связанную с процессом деградацию и повышают стабильность белков при температуре окружающей среды (например, по сравнению с сублимированными композициями). Кроме того, высушенные распылением препараты также легче перевозить, и они пригодны для производства высококонцентрированных препаратов, улучшая биодоступность белка, и разработки препаратов с локальным высвобождением (например, с доставкой в легкие) и замедленным высвобождением (например, липосомные и покрытые PLGA (поли(D,Lлактид-ко-гликолид) микросферы).

Способы и композиции по изобретению можно использовать для получения стабильной порошковой композиции или препарата, содержащих любой интересующий белок и эксципиент. В одном аспекте способы и композиции по изобретению используют для антител и их фрагментов, включая те, которые применяют in vivo и in vitro. В дополнительном варианте осуществления фрагмент антитела представляет собой фрагмент иммуноглобулина G (IgG).





Кроме того, многостадийные способы очистки и концентрирования, необходимые для получения белковых и пептидных препаратов, часто являются причиной вариабельности композиций, такой, что точный состав препарата может варьировать от партии к партии. Федеральное законодательство требует, чтобы композиции лекарственных средств были в высшей степени унифицированными по своему составу, независимо от места производства и номера партии. Способы по изобретению можно использовать для создания порошковых препаратов белков, к которым добавляют эксципиенты в точных количествах, что позволяет создавать белковые препараты с точными концентрациями эксципиентов.

В одном аспекте изобретение относится к способу получения порошкового белка или пептида, который включает распылительную сушку раствора, содержащего более чем примерно 50 мг/мл белка или пептида и по меньшей мере один эксципиент, так что получается порошковый белок или пептид. В некоторых вариантах осуществления раствор содержит более чем примерно 100 мг/мл белка или пептида. Белок может также представлять собой связывающий белок с двойным вариабельным связывающим доменом (DVD).

В некоторых вариантах осуществления способ включает получение порошкового антитела, которое включает распылительную сушку раствора, содержащего более чем примерно 50 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и по меньшей мере один эксципиент, так что получается порошковое антитело. В некоторых вариантах осуществления раствор содержит более чем примерно 100 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой иммуноглобулин G (IgG), например, MAK 195F, адалимумаб, ABT-325, ABT-308 или ABT-147. В некоторых вариантах осуществления порошок стабилен при температуре и влажности окружающей среды в течение по меньшей мере

Стр.: 5 RU 2 537 139 C2

трех месяцев и/или стабилен при 40°C в течение по меньшей мере трех месяцев.

Эксципиент может включать, например, трегалозу, сахарозу, сорбит, полиэтиленгликоль, по меньшей мере одну аминокислоту, гистидин, аланин, аргинин, глицин или их смесь. В некоторых вариантах осуществления раствор имеет соотношение эксципиент:белок от примерно 0,27:1,0 до примерно 2,8:1,0; от примерно 0,27:1,0 до примерно 1,4:1,0; от примерно 0,27:1,0 до примерно 0,7:1,0 или соотношение примерно 0,7:1,0. В некоторых вариантах осуществления раствор содержит от примерно 20 до примерно 30 мМ эксципиента или примерно 25 мМ эксципиента.

В некоторых вариантах осуществления способ включает распылительную сушку с температурой входящего воздуха (Tin) от примерно 100°C до примерно 180°C, и температурой воздуха на выходе (Tout) от примерно 60°C до примерно 110°C. В некоторых вариантах осуществления способ включает распылительную сушку с Tin примерно 130°C и Tout примерно 80°C. Способ может включать, например, распыление раствора с образованием капель раствора, высушивание капель газом с образованием порошка и извлечение порошка из газа. Способ может включать распыление раствора при помощи распылителя с нагнетательным соплом и/или отделение и извлечение порошкового антитела из газа при помощи циклонного сепаратора.

Способ может также включать помещение порошкового антитела в фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель может быть приемлемым для парентерального, перорального, энтерального и/или местного введения.

Фармацевтически приемлемый носитель может включать жидкость, такую как вода.

В другом аспекте изобретение направлено на создание фармацевтического препарата, который содержит эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, полученного любым из способов, описанных в данном документе. В еще одном аспекте изобретение направлено на создание фармацевтического препарата, который содержит эффективное количество белка или пептида, полученного любым из способов, описанных в данном документе.

В еще одном аспекте изобретение относится к стабильной порошковой композиции, содержащей белок или пептид и эксципиент, где композиция содержит менее чем примерно 6% остаточной влаги, в некоторых вариантах осуществления - менее чем примерно 4% или 3% остаточной влаги. Белок или пептид может включать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, например, антитело IgG или его антигенсвязывающий фрагмент, такое как, например, MAK 195F, адалимумаб, ABTABT-308 или ABT-147. Белок может также представлять собой связывающий белок с двойным вариабельным связывающим доменом (DVD).

В некоторых вариантах осуществления порошковая композиция стабильна при температуре и влажности окружающей среды в течение по меньшей мере трех месяцев и/или примерно при 40°C в течение по меньшей мере трех месяцев. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, или антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент сохраняет свою биологическую активность.

Эксципиент может включать трегалозу, сахарозу, сорбит, полиэтиленгликоль, по меньшей мере одну аминокислоту, гистидин, аланин, аргинин, глицин или их смесь.

Композиция может иметь массовое соотношение эксципиента (например, трегалозы и/ или сахарозы) и антитела или его антигенсвязывающего фрагмента от примерно 0,27:

1,0 до примерно 2,8:1,0, от примерно 0,27:1,0 до примерно 1,4:1,0, от примерно 0,27:1,0 до примерно 0,7:1,0 или примерно 0,7:1,0. Композиция может иметь массовое соотношение эксципиента (например, сорбита) и антитела или его антигенсвязывающего

Стр.: 6 RU 2 537 139 C2

фрагмента от примерно 0,27:1,0 до примерно 2,8:1,0, от примерно 0,27:1,0 до примерно 1,4:1,0, от примерно 0,27:1,0 до примерно 0,7:1,0 или примерно 0,7:1,0, или примерно 0,35:1.

В еще одном аспекте изобретение относится к способу производства фармацевтической композиции, который включает смешивание эффективного количества стабильной порошковой композиции по изобретению с фармацевтически приемлемым носителем, например, жидкостью, такой как вода. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция адаптирована для парентерального, перорального, энтерального или местного введения. Способ может дополнительно включать обработку стабильной порошковой композиции при температуре значительно выше температуры окружающей среды (например, экструзия расплава) без существенного влияния на стабильность порошковой композиции.

В некоторых вариантах осуществления способ включает покрытие порошковой композиции, например, полимером, таким как PLGA, для получения фармацевтической композиции с замедленным высвобождением или отсроченным высвобождением.

Дополнительно или альтернативно, способ может включать покрытие энтеросолюбильным покрытием. В некоторых вариантах осуществления активность белка, пептида, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента защищена эксципиентом от преципитации, денатурации или окисления органическими растворителями, например, PEG 400, этанолом, DMSO, NMP или ледяной уксусной кислотой.

В настоящее время почти все компании используют замороженные нерасфасованные композиции лекарственных средств и сталкиваются с такими проблемами, как воспроизводимость условий замораживания и оттаивания, непредвиденная кристаллизация эксципиентов в составе нерасфасованной субстанции лекарственного средства, сдвиг pH буферного раствора в процессе замораживания, а также длительный период задержки в связи с оттаиванием, например, 2-литрового контейнера при температурах примерно 37°C. Использование высушенных распылением сыпучих композиций лекарственных средств поможет избежать указанных проблем. Кроме того, высушенные распылением сыпучие композиции лекарственных средств очень удобны для обработки в процессе составления конечной композиции лекарственного средства и делают возможным производство в широком диапазоне концентраций. В дополнение к этому, высушенные распылением композиции лекарственных средств, к которым только добавляют воду, могут заменять классическое составление препаратов и, вследствие этого, снижают риск при производстве лекарственного средства и в то же время способствуют увеличению производственной мощности. Кроме того, полноразмерные/полные антитела могут быть менее подвержены физической деградации по сравнению с фрагментами моноклонального антитела (мАТ) (mAb). Вдобавок, как правило, существует небольшое, или полностью отсутствует, увеличение физической или химической деградации с увеличением концентрации белка вплоть до 100 мг/мл.

Поскольку более концентрированные растворы повышают эффективность процесса, использование концентраций белка 100 мг/мл будет полезно.

Краткое описание чертежей Эти и другие особенности и преимущества способов и композиций, раскрытых в данном документе, будут более понятны со ссылкой на следующее подробное описание в сочетании с прилагаемыми чертежами, где:

на фигуре 1 представлена распылительная сушилка Bchi B-191, используемая в примерах;

Стр.: 7 RU 2 537 139 C2

на фигуре 2 представлен выход и Tg различных смесей сорбит-MAK;

на фигуре 3 представлена агрегация, кристалличность и содержание воды для различных смесей сорбит-MAK;

на фигуре 4 представлены изображения сканирующей электронной микроскопии 5 (SEM) смесей сорбит-MAK 3000x (a) 25 мМ, (b) 100 мМ;

на фигуре 5 представлен выход и Tg различных смесей трегалоза-MAK;

на фигуре 6 представлена агрегация, кристалличность и содержание воды для различных смесей трегалоза-MAK;

на фигуре 7 представлены изображения SEM смесей трегалозы (3000x) (a) 10 мМ трегалоза, (b) 100 мМ трегалоза и (c) высушенная распылением чистая трегалоза;

на фигуре 8 представлен выход и Tg различных смесей сахароза-MAK;

на фигуре 9 представлена агрегация, кристалличность и содержание воды для различных смесей сахароза-MAK;

на фигуре 10 представлены данные эксклюзионной хроматографии (SEC) о физической стабильности для высушенных распылением препаратов MAK 195F: (A) влияние сорбита, трегалозы и сахарозы, и (B) влияние концентрации стабилизатора на степень агрегации белка; и на фигуре 11 представлено влияние обработки и хранения в течение 3 месяцев (A) на физическую стабильность и (B) на химическую стабильность для высушенных распылением высококонцентрированных MAK 195F, адалимумаба и ABT-325 в 200 мМ растворах трегалозы.

Подробное описание изобретения I. Определения Для того чтобы сделать настоящее изобретение более понятным, сначала дается определение некоторым терминам.

Термин «кислый компонент», используемый в данном документе, означает вещество, включая раствор, имеющее кислый pH, то есть менее чем 7,0. Примеры кислых компонентов включают фосфорную кислоту, соляную кислоту, уксусную кислоту, лимонную кислоту, щавелевую кислоту, янтарную кислоту, винную кислоту, молочную кислоту, яблочную кислоту, гликолевую кислоту и фумаровую кислоту.

Термин «антиоксидант», используемый в данном документе, должен означать вещество, которое ингибирует окисление или действует как синергист антиоксиданта, и, таким образом, используется для предотвращения порчи препаратов вследствие окислительного процесса. Такие соединения включают в качестве примера и без ограничений альфа-токоферол (витамин E), аскорбиновую кислоту, аскорбилпальмитат, лимонную кислоту, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, эдетовую кислоту (ЭДТА, эдетат) и ее соли, гидрофосфористую кислоту, яблочную кислоту, монотиоглицерин, пропионовую кислоту, пропилгаллат, метионин, аскорбат натрия, цитрат натрия, сульфид натрия, сульфит натрия, бисульфит натрия, метабисульфит натрия и другие, известные рядовому специалисту в данной области.

Если в данном документе не указано иное, термины «композиция» и «препарат»

используются взаимозаменяемо.

Термин «эксципиент» означает вещество, которое можно добавлять к препарату для обеспечения необходимой консистенции, например, для изменения объемных свойств, для улучшения стабильности и/или регулирования осмоляльности. Примеры наиболее часто используемых эксципиентов включают, но не ограничиваются ими, стабилизаторы, сахара, полиолы, аминокислоты, поверхностно-активные вещества, хелатообразующие

Стр.: 8 RU 2 537 139 C2

вещества и полимеры.

Термин «лекарственное средство», используемый в данном документе со ссылкой на композицию, например, водный препарат, представляет собой препарат, полезный для лечения заболевания или нарушения.

Термин «белок» должен включать последовательность аминокислот, в которой длина цепи является достаточной для образования более высоких уровней вторичной и/или третичной и/или четвертичной структуры. Это отличает его от «пептидов» или других низкомолекулярных молекул, которые не обладают такой структурой. Примеры белков, предусмотренных в рамках определения, используемого в данном документе, включают терапевтические белки. «Терапевтически активный белок» или «терапевтический белок» означает белок, который можно использовать для терапевтических целей, то есть для лечения нарушения у субъекта. Следует отметить, что в то время как терапевтические белки можно использовать в лечебных целях, изобретение не ограничивается только таким использованием, поскольку белки можно также использовать для исследований in vitro. В предпочтительном варианте осуществления терапевтический белок представляет собой слитый белок, либо антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В одном варианте осуществления способы и композиции по изобретению включают по меньшей мере два различных белка, которые определяют как два белка, имеющих различные аминокислотные последовательности.

Дополнительные отличающиеся белки не включают продукты распада белка.

Термин «порошковый белок» означает композицию, содержащую белок, которую получают методами распылительной сушки по изобретению. «Порошковое антитело»

означает композицию, содержащую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которую получают методами распылительной сушки по изобретению.

Термин «фармацевтический препарат» означает препарат, находящийся в такой форме, которая позволяет биологической активности активных ингредиентов сохранять эффективность, и, вследствие этого, его можно вводить субъекту для терапевтического применения.

Термин «раствор» означает смесь по меньшей мере одного эксципиента или белка, или пептида с жидкостью. Раствор может включать растворенные молекулы белка, коллоидные растворенные молекулы белка, дисперсные агрегаты белка или кристаллы, или осадки, или суспензии в жидкости, либо их сочетания.

«Стабильная» композиция представляет собой композицию, в которой, например, находящийся в ней белок в основном сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность при обработке и/или при хранении. В данной области применяются различные аналитические методы для измерения стабильности белка, и их обзор приведен, например, в Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) и Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). В одном варианте осуществления стабильность белка определяют по процентному содержанию мономера белка в растворе, с малым процентным содержанием деградированного (например, фрагментированного) и/или агрегированного белка. Например, водная композиция, содержащая стабильный белок, может содержать по меньшей мере 95% мономера белка. Альтернативно водная композиция по изобретению может содержать не более 5% агрегатов и/или деградированного белка.

Термин «стабилизатор» означает эксципиент, который улучшает или иным образом повышает стабильность. Стабилизаторы включают, но не ограничиваются ими, липоевую кислоту, -токоферол, аскорбилпальмитат, бензиловый спирт, бисульфиты,

Стр.: 9 RU 2 537 139 C2

бор, бутилированный гидроксианизол (BHA), бутилированный гидрокситолуол (BHT), аскорбиновую кислоту и ее сложные эфиры, каротиноиды, цитрат кальция, ацетил-Lкарнитин, хелатообразующие вещества, хондроитин, хондроитинсульфат, лимонную кислоту, коэнзим Q-10, ЭДТА (этилендиаминтетрауксусную кислоту, эдетата динатрий), эриторбовую кислоту, фумаровую кислоту, алкилгаллаты, глюкозамин (хитозан, гиалуронат натрия), яблочную кислоту, метабисульфит, пропилгаллат, бисульфит натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия, сульфит калия, винную кислоту, тиосульфаты, тиоглицерин, токоферол и его сложные эфиры, например, токоферола ацетат, токоферола сукцинат, токотриенал, d--токоферола ацетат, витамин C и его сложные эфиры, витамин Е и его сложные эфиры, например, витамина Е ацетат, а также их сочетания.

Термин «модификатор тоничности», используемый в данном документе, должен означать соединение или соединения, которые можно использовать для регулирования тоничности жидкого препарата. Подходящие модификаторы тоничности включают глицерин, лактозу, маннит, декстрозу, хлорид натрия, сульфат магния, хлорид магния, сульфат натрия, сорбит, трегалозу, сахарозу, рафинозу, мальтозу и другие, известные рядовому специалисту в данной области. В одном варианте осуществления тоничность жидкого препарата приближена к тоничности крови или плазмы.

Термин «антитело», используемый в данном документе, включает целые антитела и их любой антигенсвязывающий фрагмент (то есть «антигенсвязывающую часть») или одиночные цепи. «Антитело» означает гликопротеин, как правило, включающий по меньшей мере две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, связанные между собой дисульфидными связями, или его антигенсвязывающий фрагмент. Термин «антитело»

также включает его выделенные существующие в природе варианты. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначенной в данном документе VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначенной в данном документе VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. Области VH и VL можно дополнительно подразделять на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), перемежающиеся с областями, которые являются более консервативными и называются каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех

FR, расположенных от амино-конца к карбоксильному концу в следующем порядке:

FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента.

Термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела (или просто «фрагмент антитела»), используемый в данном документе, означает один или несколько фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, TNF, IL-12, IL-13). Антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, предусмотренных в рамках термина «антигенсвязывающий фрагмент» антитела, включают (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) F(ab')2-фрагмент, бивалентный фрагмент, включающий Fab-фрагменты,

–  –  –

связанные дисульфидным мостом в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), который состоит из домена VH или VL, и (vi) выделенную определяющую комплементарность область (CDR). Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, их можно соединять, используя рекомбинантные методы, при помощи синтетического линкера, который дает им возможность находиться в составе одной белковой цепи, в которой области VL и VH образуют пары, формируя моновалентные молекулы (известные как одноцепочечные Fv (scFv), смотри, например, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426, и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также должны быть предусмотрены в рамках термина «антигенсвязывающий фрагмент» антитела. Такие фрагменты антитела получают общепринятыми методами, известными квалифицированным специалистам в данной области, и данные фрагменты подвергают скринингу на полезность таким же образом, как и интактные антитела. В одном варианте осуществления изобретения фрагмент антитела выбирают из группы, состоящей из Fab, Fd, Fd', одноцепочечного Fv (scFv), scFvа и доменного антитела (dAb).

Более того, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может являться частью большей по размеру молекулы иммуноадгезина, образованной ковалентной или нековалентной ассоциацией антитела или фрагмента антитела с одним или несколькими другими белками или пептидами. Эти другие белки или пептиды могут иметь функциональные группы, которые позволяют очищать антитела или их антигенсвязывающие фрагменты или дают им возможность связываться друг с другом или другими молекулами. Так, примеры таких молекул иммуноадгезинов включают использование активной зоны стрептавидина для создания тетрамерных молекул одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) (Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6: 93-301) и использование остатка цистеина, маркерного пептида и C-концевого полигистидинового маркера для создания бивалентных и биотинилированных молекул scFv (Kipriyanov et al. (1994) Mol. Immunol. 31: 1047-1058).

Фрагменты антител, такие как Fab- и F(ab')2-фрагменты, можно получать из целых антител общепринятыми методами, такими как расщепление папаином или пепсином, соответственно, целых антител. Кроме того, антитела, фрагменты антител и молекулы иммуноадгезинов можно получать при помощи стандартных методов рекомбинантной ДНК.

Два домена антитела являются «комплементарными», когда они принадлежат к семействам структур, которые образуют родственные пары или группы, или происходят из таких семейств и сохраняют эту особенность. Например, VH-домен и VL-домен антитела являются комплементарными, два VH-домена не являются комплементарными и два VL-домена не являются комплементарными. Комплементарные домены можно найти в других членах суперсемейства иммуноглобулинов, например, V и V (или гамма и дельта) домены T-клеточного рецептора.

Термин «домен» означает свернутую белковую структуру, которая сохраняет свою третичную структуру независимо от остального белка. Как правило, домены отвечают за отдельные функциональные свойства белков, и во многих случаях могут добавляться, удаляться или переноситься на другие белки без утраты функции остальной части белка и/или домена. Под единичным вариабельным доменом антитела понимают свернутый

Стр.: 11 RU 2 537 139 C2

полипептидный домен, содержащий последовательности, характерные для вариабельных доменов антитела. Вследствие этого, он включает вариабельные домены полного антитела и модифицированные вариабельные домены, например, в которых одна или две петли заменены последовательностями, которые не характерны для вариабельных доменов антитела, или вариабельные домены антитела, которые были укорочены или содержат N- или C-концевые дополнительные фрагменты, а также свернутые фрагменты вариабельных доменов, которые сохраняют, по меньшей мере частично, активность и специфичность связывания полноразмерного домена.

Вариабельные домены по изобретению можно комбинировать для образования группы доменов, например, можно комбинировать комплементарные домены, например, VL-домены комбинируют с VH-доменами. Некомплементарные домены также можно комбинировать. Домены можно комбинировать множеством способов, включая соединение доменов ковалентным и нековалентным образом.

«dAb» или «доменное антитело» означает полипептид одного вариабельного домена 15 антитела (VH или VL), который специфически связывает антиген.

Термин «антигенсвязывающая область» или «антигенсвязывающий центр», используемый в данном документе, означает часть(ти) молекулы антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которая содержит аминокислотные остатки, взаимодействующие с антигеном, и придает антителу его специфичность и/или аффинность для антигена.

Термин «эпитоп» должен означать ту часть любой молекулы, которая способна узнаваться и связываться антителом в одной или нескольких антигенсвязывающих областях антитела. В контексте настоящего изобретения, под первым и вторым «эпитопами» понимают эпитопы, которые не являются одинаковыми и не связываются одним моноспецифическим антителом или его антигенсвязывающим фрагментом.

Словосочетание «рекомбинантное антитело» означает антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными методами, такие как антитела, экспрессируемые при помощи рекомбинантного экспрессионного вектора, трансфицированного в клетку-хозяина, антитела, выделенные из комбинаторной библиотеки антител, антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным по генам иммуноглобулина человека (смотри, например, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295), или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, включающими сплайсинг конкретных последовательностей генов иммуноглобулинов (таких как последовательности генов иммуноглобулинов человека) с другими последовательностями ДНК. Примеры рекомбинантных антител включают химерные, CDR-привитые и гуманизированные антитела.

Термин «человеческое антитело» означает антитела, имеющие вариабельные и константные области, соответствующие или происходящие из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека, как описано, например, в Kabat et al.

(смотри Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S.

Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Однако человеческие антитела по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линии человека (например, мутации, внесенные в результате случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или в результате соматической мутации in vivo), например, последовательности CDR и, в частности, CDR3.

Рекомбинантные человеческие антитела по изобретению имеют вариабельные области

Стр.: 12 RU 2 537 139 C2

и могут также включать константные области, происходящие из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека (смотри Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Однако в некоторых вариантах осуществления такие рекомбинантные человеческие антитела подвергают мутагенезу in vitro (или, если используют животное, трансгенное по последовательностям Ig человека, то соматическому мутагенезу in vivo), и, таким образом, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител являются последовательностями, которые, несмотря на то, что происходят от и родственны 10 последовательностям VH и VL зародышевой линии человека, могут не существовать естественным образом в репертуаре антител зародышевой линии человека in vivo.

Однако в некоторых вариантах осуществления такие рекомбинантные антитела являются результатом избирательного мутагенеза или обратной мутации, или и того и другого.

Термин «обратная мутация» означает процесс, при котором некоторые или все из аминокислот человеческого антитела, подвергшихся соматической мутации, заменены соответствующими остатками зародышевой линии из гомологичной последовательности антитела зародышевой линии. Последовательности тяжелой и легкой цепей человеческого антитела по изобретению отдельно выравнивают с последовательностями зародышевой линии в базе данных VBASE для выявления последовательностей с наибольшей гомологией. Отличия, имеющиеся в человеческом антителе по изобретению, устраняют возвратом к последовательности зародышевой линии путем мутирования нуклеотидов на определенных позициях, кодирующих такую отличающуюся аминокислоту(ты). Роль каждой аминокислоты, идентифицированной таким образом в качестве кандидата для обратной мутации, должна быть исследована на ее прямую или опосредованную роль в связывании антигена, и любая аминокислота, которая, как установлено после мутации, влияет на любую желательную характеристику человеческого антитела, не должна быть включена в конечное человеческое антитело.

Чтобы свести к минимуму число аминокислот, подвергающихся обратной мутации, те аминокислотные позиции, которые, как было установлено, отличаются от ближайшей последовательности зародышевой линии, но идентичны соответствующим аминокислотам во второй последовательности зародышевой линии, можно оставлять, при условии, что вторая последовательность зародышевой линии идентична и коллинеарна с последовательностью человеческого антитела по изобретению по меньшей мере по 10, предпочтительно по 12 аминокислотам, с обеих сторон от интересующей аминокислоты. Обратная мутация может иметь место на любом этапе оптимизации антитела.

Термин «химерное антитело» означает антитела, которые содержат последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей из одного вида, а последовательности константных областей из другого вида, например, антитела, имеющие вариабельные области тяжелой и легкой цепей мыши, соединенные с константными областями человека.

Термин «CDR-привитое антитело» означает антитела, которые содержат последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей из одного вида, но в которых последовательности одной или нескольких CDR-областей VH и/или VL заменены последовательностями CDR из другого вида, например, антитела, имеющие вариабельные области тяжелой и легкой цепей мыши, в которых одна или более

Стр.: 13 RU 2 537 139 C2

мышиных CDR (например, CDR3) заменены последовательностями CDR человека.

Термин «гуманизированное антитело» означает антитела, которые содержат последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей из видов, отличных от человека (например, мыши), но в которых по меньшей мере часть последовательности VH и/или VL была изменена, чтобы стать более «человеческой», то есть более сходной с вариабельными последовательностями зародышевой линии человека. Один тип гуманизированного антитела представляет собой CDR-привитое антитело, в котором последовательности CDR человека вводят в последовательности VH и VL, отличные от человеческих, для замены соответствующих последовательностей CDR, отличных от человеческих.

Различные аспекты изобретения описаны более подробно в следующих подразделах.

II. Способы по изобретению Способы по настоящему изобретению и полученные композиции по настоящему изобретению обладают множеством преимуществ для доставки и/или распространения лекарственной субстанции, например, препараты являются более легкими и стабильными при температуре окружающей среды. Существуют также преимущества для составления и/или производства лекарственных средств, например, отсутствие длительного оттаивания нерасфасованных растворов с контролируемой скоростью. Можно легко отвешивать сухие порошковые белки по настоящему изобретению в количествах, достаточных для нужных концентраций, и смешивать или составлять препарат с нужными эксципиентами, такими как вода. Также нет необходимости в отделении и высушивании белковых осадков или суспензий белковых кристаллов, как в случае обычных препаратов. Существуют и другие преимущества для разработки лекарственного продукта с точки зрения возможности достижения высокой концентрации препаратов, улучшения биодоступности, локального высвобождения (например, доставки в легкие), замедленного высвобождения (например, липосомы и покрытые PLGA микросферы), а также новых твердых или гидрогелевых белковых лекарственных форм, которые можно вводить множеством способов, включая пероральный и местный. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления способы также включают дальнейшую обработку, например, встраивание порошковых композиций в покрытые композиции с замедленным высвобождением, липосомы, покрытые PLGA микросферы, встраивание в матрицы эксципиентов путем экструзии расплава и тому подобное. Полученные композиции также являются дополнительными вариантами осуществления настоящего изобретения, например, композиции с замедленным высвобождением или нацеленные композиции и/или композиции, делающие возможными альтернативные пути введения, например, пероральное, кожное и энтеральное введение. Еще одним преимуществом является то, что композиции по настоящему изобретению можно обрабатывать при более высоких температурах, чем обычные препараты. Например, порошки можно обрабатывать методом экструзии расплава, таким как метод экструзии расплава MELTREX.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам эффективного и действенного получения стабильных порошков, которые включают один или более белков или пептидов. В некоторых вариантах осуществления белки или пептиды представляют собой антитела и/или их антигенсвязывающие фрагменты. Способ получения порошка включает распылительную сушку раствора белка, пептида, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Например, раствор может содержать по меньшей мере примерно 50 мг/мл белка, пептида, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. В дополнительных вариантах осуществления раствор может иметь другую

Стр.: 14 RU 2 537 139 C2

концентрацию, например, быть более концентрированным, например, раствор может содержать по меньшей мере примерно 40 мг/мл, 50 мг/мл, 60 мг/мл, 70 мг/мл, 80 мг/мл, 90 мг/мл, 100 мг/мл, 130 мг/мл, 150 мг/мл, 180 мг/мл и так далее белка, пептида, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Раствор может также содержать один или несколько эксципиентов. Способ может включать концентрирование или дополнительное концентрирование раствора любым известным методом, включая, например, ультрафильтрацию. Белок или пептид может представлять собой любой подходящий белок или пептид. Белок может представлять собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, например, антитело иммуноглобулин G (IgG) или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой MAK 195F, адалимумаб, ABTABT-308 или ABT-147.

В некоторых вариантах осуществления раствор содержит эксципиент. Подходящие эксципиенты включают, но не ограничиваются ими, трегалозу, сахарозу, сорбит, полиэтиленгликоль, по меньшей мере одну аминокислоту, гистидин, аланин, аргинин, глицин или их смесь. Способ может дополнительно включать добавление кислого компонента, антиоксиданта и/или модификатора тоничности к раствору или к порошку.

Раствор может содержать от примерно 15 до примерно 140 мМ, или от примерно 20 до примерно 30 мМ эксципиента. В некоторых вариантах осуществления раствор содержит примерно 25 мМ эксципиента. В некоторых вариантах осуществления раствор имеет соотношение эксципиент:белок от примерно 0,27:1,0 до примерно 2,8:1,0, от примерно 0,27:1,0 до примерно 1,4:1,0 или от примерно 0,27:1,0 до примерно 0,7:1,0. В некоторых вариантах осуществления раствор имеет соотношение эксципиент:белок примерно 0,7:1,0.

В некоторых вариантах осуществления раствор имеет низкое процентное содержание белковых агрегатов, несмотря на высокую концентрацию водного белкового препарата.

В одном варианте осуществления водный раствор, включающий воду и высокую концентрацию белка, например, антител, содержит менее чем примерно 5% белковых агрегатов, даже при отсутствии поверхностно-активного вещества или другого типа эксципиента. В одном варианте осуществления раствор содержит не более чем примерно 7,3% агрегированного белка, раствор содержит не более чем примерно 5% агрегированного белка, раствор содержит не более чем примерно 4% агрегированного белка, раствор содержит не более чем примерно 3% агрегированного белка, раствор содержит не более чем примерно 2% агрегированного белка, или раствор содержит не более чем примерно 1% агрегированного белка. В одном варианте осуществления раствор содержит по меньшей мере примерно 92%, по меньшей мере примерно 93%, по меньшей мере примерно 94%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 97%, по меньшей мере примерно 98% или по меньшей мере примерно 99% мономера белка. Диапазоны, промежуточные для приведенных выше концентраций, например, по меньшей мере примерно 98,6% мономера белка, не более чем примерно 4,2% агрегированного белка, также предназначены являться частью данного изобретения. Кроме того, диапазоны значений при использовании сочетания любых из приведенных выше значений в качестве верхней и/ или нижней границ также предусмотрены для включения.

В некоторых вариантах осуществления температура входящего воздуха (Tin) составляет от примерно 105°C до примерно 175°C, от примерно 130°C до примерно 155°C, от примерно 120°C до примерно 160°C или от примерно 125°C до примерно 160°C. В некоторых вариантах осуществления Tin составляет примерно 130°C. В

–  –  –

некоторых вариантах осуществления температура воздуха на выходе (Tout) составляет от примерно 60°C до примерно 112°C, от примерно 60°C до примерно 90°C, от примерно 70°C до примерно 90°C или от примерно 75°C до примерно 85°C. В некоторых вариантах осуществления Tout составляет примерно 80°C.

В некоторых вариантах осуществления способы по изобретению включают распылительную сушку с температурой входящего воздуха (Tin) от примерно 100°C до примерно 180°C и температурой воздуха на выходе (Tout) от примерно 60°C до примерно 110°C. В некоторых вариантах осуществления способ включает распылительную сушку с Tin примерно 130°C и Tout примерно 80°C.

В некоторых вариантах осуществления остаточное содержание влаги в полученной порошковой композиции составляет от примерно 1% до примерно 3%, от примерно 1,5% до примерно 2,5%, от примерно 1,4% до примерно 2%, от примерно 4% до примерно 6% или от примерно 4,5% до примерно 5%. В других вариантах осуществления порошковая композиция содержит примерно 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5% или 7% остаточной влаги.

В одном варианте осуществления порошок стабилен при температуре и влажности окружающей среды в течение по меньшей мере 3 месяцев. В некоторых вариантах осуществления порошок стабилен в течение по меньшей мере 6 месяцев, 9 месяцев, 1 года, 2 лет, 3 лет или 5 лет при температуре и влажности окружающей среды. В других вариантах осуществления порошок стабилен при 40°C в течение по меньшей мере 3 месяцев. В дополнительных вариантах осуществления порошок стабилен при 40°C в течение по меньшей мере 3 месяцев, 6 месяцев, 9 месяцев, 1 года, 2 лет или 5 лет.

В некоторых вариантах осуществления распылительная сушка включает распыление раствора с образованием капель раствора, высушивание капель газом с образованием порошка и извлечение порошка из газа. Раствор можно распылять при помощи, например, распылителя с нагнетательным соплом. Порошок можно извлекать, например, при помощи циклонного сепаратора. Типичные способы распылительной сушки обсуждаются и иллюстрируются примерами в данном документе.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтического препарата, который может включать любой из способов, описанных в данном документе для получения порошков, и дополнительно включает смешивание (например, погружение или растворение) порошка с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтически приемлемый носитель может являться любым носителем, приемлемым для парентерального, перорального, энтерального или местного введения.

Носитель может быть твердым, полутвердым или жидким (например, вода), либо их сочетаниями.

В некоторых вариантах осуществления способ включает растворение порошкового антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в фармацевтически приемлемом носителе. Фармацевтически приемлемый носитель может, например, быть приемлемым для парентерального введения и может включать, например, воду. Способ может дополнительно включать добавление одного или нескольких кислых компонентов, антиоксидантов и/или модификаторов тоничности к фармацевтической композиции.

Дополнительно или альтернативно, к фармацевтическим композициям по изобретению можно добавлять подходящие добавки, например, буферные растворы, модификаторы вязкости, ароматизаторы, красители и так далее.

Способ может включать дополнительную обработку стабильной порошковой композиции по изобретению при температуре выше температуры окружающей среды

–  –  –

без существенного влияния на стабильность порошковых композиций. Например, способ может включать экструзию расплава стабильной порошковой композиции.

В некоторых вариантах осуществления на порошковую композицию наносят одно или более покрытий, например, так, что отдельные частицы или агрегаты частиц являются покрытыми, и/или так, что совокупность частиц, например, прессованная таблетка, является покрытой. Покрытие может включать любое покрытие, обычно используемое в данной области. Такие покрытия могут включать полимеры, такие как PLGA, для создания фармацевтической композиции с замедленным высвобождением или отсроченным высвобождением. Покрытия могут представлять собой или включать энтеросолюбильное покрытие. Композицию можно инкапсулировать, например, в желатиновую капсулу, или суспендировать в гидрогеле. В некоторых вариантах осуществления активность белка, пептида, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента защищена таким или иным образом эксципиентом от преципитации, денатурации или окисления органическими растворителями, тем самым позволяя проводить покрытие такими веществами, как PLGA, которые растворимы только в органических растворителях. Такие растворители могут включать растворители, обычно встречающиеся в фармацевтических препаратах, включая, но не ограничиваясь ими, полиэтиленгликоль (например, с низким молекулярным весом, такой как PEG 400), этанол, диметилсульфоксид (DMSO), N-метилпирролидон (NMP) или ледяную уксусную кислоту.

Распылительная сушка В распылительной сушилке прокачиваемая жидкость (раствор, суспензия, эмульсия или паста) приобретает форму высушенных твердых частиц. Процесс сочетает образование частиц и высушивание в одном этапе путем распыления подаваемой жидкости в горячую высушивающую среду (как правило, воздух или инертные газы).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения концентрированные белковые растворы высушивают распылением. Соответственно, способы по изобретению могут включать концентрирование белковых растворов с помощью любого подходящего метода. В некоторых вариантах осуществления используют метод тангенциальной фильтрации потока (TFF), поскольку это очень быстрый и щадящий метод. Однако дополнительно или альтернативно можно использовать нормальную фильтрацию потока или диализ.

Распыление жидкости приводит к увеличению поверхности жидкости и, вследствие этого, приводит к сильному сокращению времени высыхания. Например, уменьшение размера капли с 10 мкм до 1 мкм приводит к увеличению площади поверхности с 600 до 6000 м2 и сокращает время высыхания в 100 раз (от 0,01 с до 0,0001 с). Stahl, Feuchtigkeit und Trocknen in der Pharmazeutischen Technologie. Dr. Dieter Steinkopf Verlag GmbH & Co. KG, Darmstadt (1999).

Контакт между подаваемой жидкостью и высушивающим воздухом может происходить двумя различными способами. В прямоточной системе высушивающий воздух и частицы (капли) движутся через сушильную камеру в одном направлении. Это наиболее предпочтительный способ для чувствительных к нагреванию материалов (таких как белки), поскольку наиболее горячий воздух контактирует с влажными каплями. Когда высушивающий воздух и капли движутся в противоположном направлении, это называют противоточным способом. Частицы, получаемые с помощью противоточного способа, имеют более высокую температуру, чем выходящий воздух.

Сам выходящий воздух может покидать систему («открытый цикл») или может рециркулировать («замкнутый цикл», как правило, используемый для выпаривания

Стр.: 17 RU 2 537 139 C2

органических растворителей с помощью инертных газов). Spray Drying Process Principles («www.niro.com», Feb. 2007). Путем выбора из различных конструкций распылительных сушилок (размер, распылитель, асептические условия и так далее) и настройки различных параметров процесса (поток высушивающего воздуха, температура высушивающего воздуха и так далее) можно контролировать свойства полученного порошка, такие как размеры, форма и структура или даже стерильность частиц. Если остаточная влажность извлеченного порошка недостаточно низка, может потребоваться последующая обработка, например, в виде сушилок в кипящем слое и охлаждающих устройств, контактных сушилок и даже микроволновых сушилок. Masters, Spray Drying in Practice.

SprayDryConsiilt International ApS; Charlottenlund (2002).

Процесс распылительной сушки, как правило, включает: распыление подаваемой жидкости, высушивание капель, а также разделение и извлечение высушенного продукта.

Каждый этап по-своему влияет на полученный продукт и имеет свои сложности, особенно в случае чувствительного материала, такого как белки.

Для того чтобы высушивать распылением белок или пептид, часто бывает полезно использовать стабилизирующие адъюванты. Сахара, такие как трегалоза и сахароза, являются эффективными стабилизаторами белков. Они не только могут уменьшать агрегацию и/или инактивацию белков в процессе сушки распылением, они также могут оказывать положительное влияние на стабильность при хранении полученного порошка в условиях хранения ниже температуры стеклования. Lee, Rational Design of Stable Protein Formulations, Theory and Practice (Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2002).

Распыление представляет собой фрагментацию жидкости на множество отдельных капель, так называемый аэрозоль. Выбор устройства для распыления влияет на качество конечного продукта и пропускную способность. Richter, Verfahrenstechnik, Sonderausgabe Martbersicht 11: 96-100 (1997). Общим для всех распылителей является использование энергии для дробления жидкости. Различные виды энергии отличают различные распылители. Энергия вызывает турбулентность в выпускаемой жидкости. Вместе с приложенными воздушными силами, поверхностное натяжение и вязкость жидкости преодолеваются, и происходит дезинтеграция.

Для процесса распылительной сушки наиболее подходящим аэрозолем является аэрозоль с небольшими каплями более или менее одинакового размера. Не все системы распыления способны обеспечивать узкий диапазон размеров частиц для высушиваемых распылением порошков. Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002). Белки являются очень чувствительным материалом, следовательно, распыление является стрессовым фактором, поскольку оно подразумевает наличие усилия сдвига, возможной причины нестабильности. Mahler et al. обнаружили корреляцию между высоким усилием сдвига (перемешивание и встряхивание) и увеличением агрегации в растворе IgG1. Mahler et al., Eur. Journal of Pharm. and Biopharm. 59: 407-417 (2005). В растворе лизоцима также обнаружена агрегация и потеря активности при распылении. Yu et al., Eur. Journal of Pharm. Sci. 27: 9-18 (2006).

Напряжение сдвига и резкое увеличение границы раздела жидкость/воздух, судя по всему, являются причиной для такого рода ухудшения качества белка. Maa et al., Biotechnology and Bioengineering 54(6): 503-512 (1997). Но даже усилий сдвига, которые имеют место в процессе перекачивания, может оказаться достаточно для подвергания стрессу раствора белка. Brennan et al., Diabetes 34, 353-359 (1985). Для распылительной сушки можно использовать множество распылителей различных типов.

Роторные распылители ускоряют подаваемую жидкость под действием центробежных сил до подачи ее в атмосферу воздуха/газа. Подаваемая жидкость распределяется

Стр.: 18 RU 2 537 139 C2

централизованно на вращающееся колесо, диск или чашку. При низкой скорости диска образование капель в основном зависит от вязкости и поверхностного натяжения жидкости. Чем выше скорость диска, тем больше инерция и трение воздуха вступают в игру и вносят вклад в механизм образования капель. Кроме того, размер капель зависит от скорости подачи жидкости, ее твердого содержания и плотности, диаметра диска распылителя и конструкции. Существуют различные конструкции роторных распылителей: безлопастные диски/стаканы/чашки или лопастные колеса с изогнутыми или прямыми лопастями. Masters, Spray Drying Handbook (Wiley & Sons Inc., New York, 1991).

Роторные распылители имеют угол разбрызгивания 360° и, вследствие этого, требуют определенного диаметра сушильной камеры (для уменьшения осаждения на стенках).

Эти системы обычно используют для больших емкостей.

Системы с нагнетательным соплом получают всю энергию, необходимую для подачи жидкости, от самой жидкости путем преобразования энергии давления в кинетическую энергию. Простейшее сопло для одной жидкости представляет собой трубчатый капилляр, используемый для выпускания отдельных капель. Это устройство используется только для создания небольших количеств одинаковых капель. При увеличении скорости потока можно достигнуть распыления, при котором струя жидкости дробится на капли при помощи турбулентности. Можно повысить качество дезинтеграции жидкости, если заставить жидкость отклоняться от прямого направления, совершать вращения и повороты, например, путем снабжения сопла вихревыми вставками или вихревыми камерами. Размер полученных капель зависит от приложенного давления и диаметра сопла, помимо обсуждавшихся выше параметров (вязкости, скорости потока и так далее). Richter, Verfahrenstechnik, Sonderausgabe Martbersicht 11: 96-100 (1997). Подаваемая жидкость покидает отверстие в виде полого конуса, то есть нагнетательные сопла можно использовать в небольших распылительных сушильных установках с малым диаметром сушильных камер. Большое количество различных конструкций сопла можно по-разному использовать для распыления растворов, эмульсий и суспензий, с ограничением только по размеру частиц (суспензии) и вязкости (необходимо очень высокое давление). Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS;

Charlottenlund (2002).

При использовании распыления пневматическим соплом столкновение высокоскоростной газообразной среды (как правило, воздуха) с жидкостью дает энергию для образования капель. В зависимости от места, где происходит столкновение жидкости и газа, различают системы внутреннего смешивания и внешнего смешивания.

Richter, Verfahrenstechnik, Sonderausgabe Martbersicht 11: 96-100 (1997). Два жидкостных сопла предпочтительно используют, когда очень вязкие жидкости нужно разбить на мелкие капли. Газовая среда подвергается давлению внутри сопла (вплоть до 7 бар), которое иногда снабжено дополнительной вихревой вставкой для создания турбулентности газа, облегчающей дезинтеграцию подаваемой жидкости. Последняя, как правило, закачивается наносами низкого давления, поддерживающими эжекторный эффект воздушного потока. Системы пневматического сопла производят капли в диапазоне от 5 до 75 мкм. К недостаткам можно отнести высокую стоимость сжатого газа/воздуха и его охлаждающий эффект внутри сушильной камеры. При работе с жидкостями с очень высокой вязкостью существует также опасность забивания отверстия сопла. Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS;

Charlottenlund (2002).

В ультразвуковых соплах для распыления используются звуковые волны высокой

Стр.: 19 RU 2 537 139 C2

частоты. Пьезоэлектрические преобразователи получают электрическую энергию высокой частоты из ультразвукового генератора и превращают ее в вибрационное механическое движение с той же частотой. Вводимая жидкость пробегает по длине сопла. Когда подаваемая жидкость достигает отверстия, она поглощает вибрационную энергию, вызывающую ее распыление, Sono Tek Corporation; Ultrasonic spray nozzle systems (SONO TEK Corporation, New York, 2007).

Звуковые сопла работают при низких давлениях (особенно по сравнению с пневматическими соплами), и полученные капли имеют диаметр от 10 до 50 мкм. Один большой недостаток использования ультразвуковых распылителей заключается в непредсказуемости непрерывной работы, например, при использовании для содержащего твердые вещества сырья, риск предварительного высушивания в области сопла может привести к неполадкам в генераторе/процессе распыления. Вследствие этого, данные системы наиболее часто используют в лабораторных условиях и вспомогательных сушилках для получения мелкодисперсных аэрозолей, либо когда неньютоновские или очень вязкие жидкости не позволяют использовать другие системы сопла. Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002).

Прогнозирование кинетики высушивания аэрозолей в процессе распылительной сушки осложняется как трудностями в осуществлении контроля за поведением всего аэрозоля, так и неоднородными условиями внутри сушильной камеры. Однако кинетику высушивания отдельных капель можно изучать теоретически и практически. Elversson et al., Journal of Pharm. Sci 94(9): 2049-2060 (2005).

Как только подаваемая жидкость распыляется, отношение ее поверхности к массе возрастает, передача тепла между воздухом и каплями ускоряется, и теперь капли могут высыхать очень быстро. При обычных размерах капель 100 мкм, испарение происходит в течение менее чем 1 с. Nrnberg et al., Acta Pharmaceutica Technologica, 26 (1): 39-67, Tab 3-1 (1980). Происходят два конвекционных процесса: передача тепла (воздухкапля) и массоперенос влаги (каплявоздух). В последнем случае, влага должна проникать через пограничный слой, который окружает каждую каплю. На скорость передачи влияют температура, влажность, транспортные свойства окружающего воздуха, диаметр капель и относительная скорость между каплями и воздухом. Masters, Spray Drying Handbook (Wiley & Sons Inc., New York, 1991). Сначала испарение происходит с постоянной скоростью (первая стадия высушивания = период постоянной скорости).

Диффузия влаги изнутри капли поддерживает условия насыщенной поверхности. В так называемой «критической точке» содержание влаги становится слишком низким, чтобы сохранять насыщенность на поверхности капли, и сухой слой начинает образовываться на поверхности капли. С этого момента существует дополнительный возрастающий барьер для пересечения при помощи диффузии. В результате постоянно меняющихся условий капли/частицы скорость испарения снижается (период снижения скорости = второй этап высушивания). Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002). Температура капель/частиц во время процесса в основном зависит от температуры входящего высушивающего воздуха (Tin) и скорости подаваемой жидкости (QLF), в некоторой степени от скорости потока высушивающего воздуха (QDA) и скорости потока распыляющего воздуха (QAA). Эти четыре параметра также определяют Tout. На практике, температура чуть ниже отверстия сопла гораздо ближе к Tout, чем к Tin, так что Tout, очевидно, является доминирующей переменной для скорости высушивания капли. Разумеется, температура внутри капли (Ti) ниже, чем на ее поверхности (Ts). Ts вскоре достигает температуры смоченного термометра, Twb, и

Стр.: 20 RU 2 537 139 C2

остается такой в течение периода постоянной скорости. С ростом корки на поверхности капли в период снижения скорости, Ts и Ti начинают возрастать, Maa et al., Biotechnology and Bioengeneering 53 (6): 503-512 (1997). Для морфологии полученной капли решающую роль играет размер капли, а также текстура корки. Elversson et al. постулировали 5 линейную зависимость между размерами капель и размерами частиц, но также предположили, что содержание твердых веществ в подаваемой жидкости сильно влияет на размер частиц. Elversson et al., Journal of Pharm. Sci. 92(4): 900-910 (2003).

Сушка подразумевает еще два стрессовых фактора для белков: нагревание и дегидратацию. Устойчивость белков к тепловому стрессу является важнейшей 10 переменной в белковом препарате. Изменения температуры во время процесса распылительной сушки оказывают огромное влияние на стабильность белка (например, стабильность в процессе, срок годности в ускоренных испытаниях стабильности). Под воздействием повышенных температур белки становятся более гибкими (водородные связи ослабевают), что приводит к частичному развертыванию, и возрастает их частота 15 соударений. Brange, Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins (Taylor & Francis Ltd., 2000). Этот процесс, как правило, обратим, однако, будучи частично развернуты, белки становятся очень чувствительными к другим путям деградации, таким как агрегация или неправильное свертывание, что сильно влияет на их функцию и долгосрочную стабильность.

20 Для большинства белков температура для максимальной стабильности составляет от -10 до 35°C. Bummer et al., Protein Formulation and Delivery (Marcel Dekker AG, Basel, 2000). Mumenthaler et al. предположили, что высыхающие частицы достигают максимальной температуры примерно 25°C ниже Tout. Mumenthaler et al., Pharm. Res. 11 (1): 12-20 (1994). По настоящему изобретению Tout может находиться в диапазоне от примерно 60°C до примерно 80°C. Тепловая денатурация, как правило, не считается основным фактором нестабильности в процессе распылительной сушки. Maa et al., Current Pharmaceutical Biotechnology 1(3): 283-302 (2000).

Биологическая активность белков зависит от их нативной трехмерной структуры.

В водном растворе белки сохраняют свою нативную структуру благодаря тому, что они окружены нековалентно связанными молекулами воды на их поверхности. Как правило, неполярные аминокислотные остатки погружены внутрь, а полярные аминокислотные остатки находятся на поверхности. Это приводит к более плотной группировке белков в растворе (более высокая плотность размещения, чем в кристаллах органических молекул). Brange, Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins (Taylor & Francis Ltd., 2000). Удаление воды может дестабилизировать эту группировку, и могут происходить конформационные изменения.

Последним этапом в процессе распылительной сушки, как правило, является отделение порошка от воздуха/газа и удаление высушенного продукта. В некоторых вариантах осуществления данный этап является настолько эффективным, насколько возможно, чтобы получить высокий выход порошка и предотвратить загрязнение воздуха в результате выброса порошка в атмосферу. С этой целью можно использовать оборудование для сухой и влажной сборки, такое как циклонные сепараторы, мешочные фильтры или электростатические осадители. Можно устанавливать даже комбинации таких блоков. Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS;

Charlottenlund (2002). Благодаря своей простой конструкции и эффективности, циклонный сепаратор является одним из наиболее распространенных сепараторов и используется в различных отраслях промышленности. Coulson and Richardson, Chemical Engineering,

Стр.: 21 RU 2 537 139 C2

4th, Vol.2 (Butterworth-Heinemann, Oxford, 1991). Движение частиц внутри циклона является результатом действия двух противоположных сил. Центробежная сила перемещает частицы к стенкам циклона, в то время как сила сопротивления воздуха/газа стремится перенести частицы в центральный воздушный сердечник для выхода из циклона. Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002). Порошок и воздух поступают в циклон по касательной и кружатся по спирали вниз по направлению к дну циклона (внешний вихрь). В этот момент большинство частиц покидает циклон и собирается в помещенный на дно сосуд, воздух, содержащий только фракцию мелких частиц и других частиц, которые не могут быть отделены, движется по спирали вверх в центре (внутренний вихрь) циклона и выходит через верх. На практике, частицы размером более 30 мкм должны быть извлечены, что также зависит от размеров распылительной сушки. Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002). Однако выход можно оптимизировать за счет изменения размеров циклона. Maury et al. достигли более высоких выходов, используя недавно разработанный циклонный сепаратор на распылительной сушилке Buchi Bпо сравнению со стандартным циклоном. Maury et al., Eur. Journal of Pharm. and Biopharm. 59(3): 565-573 (2005). Высокоэффективный циклон (с малым диаметром) разделял больше, в том числе даже очень мелкие частицы (диаметром менее 1,5 мкм).

Была выполнена теоретическая работа по расчету эффективности циклона.

Один подход заключается в вычислении так называемой «точки отсечения», например, по следующей формуле:

dp* представляет собой диаметр отсекаемых частиц, представляет собой вязкость воздуха, ri означает радиус внутреннего вихря, vri представляет собой радиальную скорость воздуха на входе, ps и pg представляют собой плотности твердого вещества и газа, ui представляет собой тангенциальную скорость частицы при ri. В данной точке (диаметр частицы) центробежная сила и сила сопротивления имеют одинаковые значения. Частицы такого размера вращаются, не направляясь ни к внутреннему, ни к внешнему вихрю, меньшие частицы увлекаются выходящим воздухом, большие частицы попадают в собирающий сосуд. Staudinger et al., VDI Berichte 1511: 1-23 (1999).

Подход, касающийся времени полета, представляет собой еще один способ рассчитать критический диаметр частиц. Согласно ему, учитывают, сколько времени занимает перемещение частицы к стенке циклона. При таком подходе можно принимать во внимание геометрические характеристики собирающего сосуда, поскольку они влияют на поток газа внутри циклона. Qian et al., Chem. Eng. Technol. 29(6): 724-728 (2006).

Распылительная сушка водного раствора белка без адъювантов, как правило, ведет к развертыванию, агрегации и инактивации. Это испытывали несколько раз с различными белками: оксигемоглобином (Labrude et al.), трипсиногеном (Tzannis et al.), IgG (Maury et al. 2005), и во всех случаях наблюдали появление нестабильности. Labrude

et al., Journal of Pharm. Sci. 78(3): 223-229 (1989), Tzannis, et al., Journal of Pharm. Sci. 88(3):

351-359 (1999) и Maury et al., Eur. Journal of Pharm. and Biopharm. 59(2): 251-261 (2005).

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления композиции по изобретению защищают активный фармацевтический ингредиент (API) во время процесса

Стр.: 22 RU 2 537 139 C2

распылительной сушки, а также во время хранения. При сублимационной сушке белков в качестве стабилизирующих средств были использованы сахара (трегалоза, сахароза), аминокислоты (аргинин) или поверхностно-активные вещества (Tween). Lee, Rational Design of Stable Protein Formulations, Theory and Practice (Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2002). Для использования полиолов, дисахаридов и аминокислот было предложено несколько теорий стабилизации. Одной из них является так называемая теория «предпочтительного исключения», созданная Arakawa и Timasheff. Arakawa et al., Biochemistry 21: 6536-6544 (1982), Arakawa et al., Advanced Drug Delivery Reviews 46: 307и Timasheff, Annual Reviews Biophys. Biomol. Struct., 22: 67-97 (1993). Она основана на предпосылке, что белки в растворе являются преимущественно гидратированными, так что сорастворенные вещества не имеют контакта с поверхностью белка. Поскольку развертывание приведет к увеличению поверхности белка, также увеличится и площадь, контакт с которой должен быть исключен для сорастворенных веществ. В данном случае развертывание приводит к термодинамически неблагоприятной ситуации, следовательно, белок остается в естественной свернутой конформации. Arakawa et al., Advanced Drug Delivery Reviews 46: 307-326 (2001). Белки также могут быть защищены механизмом «замены воды». Эта теория утверждает, что эксципиенты предотвращают развертывание путем образования водородных связей с сухим белком вместо испарившейся воды. Carpenter et al., Rational Design of Stable Protein Formulations, Theory and Practice (Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2002). Кроме того, образование стеклообразной матрицы, которая иммобилизует белок, может являться причиной стабильности белка при сушке и хранении. Tzannis et al., Journal of Pharm. Sci.

88(3): 360-370 (1999). Таким образом, необходимы препараты, которые обладают высокой температуры стеклования (Tg), например, Tg более высокой, чем температура 25 хранения, чтобы препятствовать молекулярному движению. Механизм стабилизации поверхностно-активных веществ основан на конкуренции поверхностно-активных веществ и белков за поверхности раздела (например, поверхности раздела жидкость/ воздух), демонстрирующие термодинамическое преимущество для поверхностноактивного вещества. При небольшой возможности для белка адсорбироваться на 30 поверхности раздела, риск развертывания и агрегации значительно снижается. Adler et al., Journal of Pharm. Sci., 88 (2), 199-208 (1999).

Влажность представляет собой другой фактор, влияющий на стабильность белка, особенно в течение длительного срока хранения. Воздействие влаги на порошковые белки подробно описано в литературе. Как правило, химическая стабильность твердого 35 белкового препарата уменьшается с увеличением содержания влаги из-за воды, выступающей в качестве реагента или в качестве средства для мобилизации реагентов.

Она также может нести ответственность за конформационные изменения в структуре белка. Кроме того, Tg высушенных распылением порошков также зависит от воды.

Вода действует как пластификатор, это означает, что она снижает Tg вещества. Влияние воды можно рассчитать при помощи уравнения Гордона Тейлора, уравнения для расчета Tg бинарных смесей (Tgmix).

, Tg и представляют собой массовую долю, температуру стеклования и плотность различных компонентов, соответственно. Поскольку вода имеет Tg примерно -138°C,

–  –  –

очевидно, что содержание воды в полученных порошках должно быть низким. Hancock et al., Pharm. Res. 11(4): 471-477 (1994). Однако корреляция между содержанием воды и стабильностью, очевидно, не является линейной. Chang et al. получили оптимальную стабилизацию лиофилизированного IgG при промежуточном содержании воды 2-3%.

Chang et al., Journal of Pharm. Sci., 94(7): 1427-1444 (2005).

Исходя из данной информации, порошок, полученный методом распылительной сушки, должен иметь низкую остаточную влажность и, кроме того, быть защищен от влажности при хранении. Maa et al., Pharm. Res. 15(5): 768-775 (1998). Первое может в определенной степени зависеть от условий процесса (температура входящего воздуха (Tin), относительная влажность (RH) входящего воздуха); последнее зависит от герметичности сосудов или контролируемых условий хранения.

III. Препараты по изобретению Любой подходящий белок, пептид, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент можно использовать для получения композиций по настоящему изобретению. Например, 15 он может представлять собой IgG. Типичные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты включают, но не ограничиваются ими, MAK 195F, адалимумаб или ABTАнти-TNF антитела, пригодные для использования по изобретению, хорошо известны (например, как описано в EP-A-0260610, EP-A-0351789, EP-A-0218868). Можно использовать как поликлональные, так и моноклональные антитела. Более того, 20 подходящими являются также фрагменты TNF-связывающего антитела, такие как Fabили F(ab')2-фрагменты, либо одноцепочечные Fv-фрагменты. Подходящее моноклональное анти-hTNF-альфа антитело описано в EP-A-0260610, обозначенное AM-195 или MAK-195, которое продуцируется гибридомной клеточной линией, депонированной в ECACC под регистрационным номером 87 050803. Подходящим является и фрагмент (F(ab')2) мышиного анти-TNF антитела, также обозначаемый MAK 195F (INN: афелимомаб).

В одном варианте осуществления препарат по изобретению содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывает TNF человека, включая, например, адалимумаб (другие названия: хумира или D2E7; Abbott Laboratories). В одном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент диссоциирует от TNF человека с Kd, равной 110-8 M или меньше, и константой скорости Koff, равной 110-3 с-1 или меньше, обе величины определены поверхностным плазмонным резонансом, и нейтрализует цитотоксичность TNF человека в стандартном тесте in vitro с использованием L929 с IC50 110-7 M или меньше. Примеры и способы получения человеческих нейтрализующих антител, имеющих высокую аффинность для TNF человека, включая последовательности таких антител, описаны в патенте США № 6090382, включенном в данный документ посредством ссылки.

В одном варианте осуществления препарат по изобретению содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывает интерлейкин-12 (IL-12) человека, включая, например, антитело ABT-874 (Abbott Laboratories) (патент США № 6914128).

ABT-874 представляет собой полностью человеческое моноклональное антитело, предназначенное нацеливаться и нейтрализовать интерлейкин-12 и интерлейкин-23. В одном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет одну или более из следующих характеристик: оно диссоциирует от IL-1 человека с KD 310-7 M или меньше, диссоциирует от IL-1 человека с KD 510-5 M или меньше и не

–  –  –

связывает IL-1 мыши или IL-1 мыши. Примеры и способы получения человеческих нейтрализующих антител, имеющих высокую аффинность для IL-12 человека, включая последовательности антитела, описаны в патенте США № 6914128, включенном в данный документ посредством ссылки.

В одном варианте осуществления препарат по изобретению содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывает IL-18 человека, включая, например, антитело ABT-325 (Abbott Laboratories) (смотри патентную заявку США № 2005/0147610).

В одном варианте осуществления препарат по изобретению содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывает IL-12 человека, такое как антитело ABT-147 (Abbott Laboratories) (смотри WO 2007/005608 A2, дата публикации 11 января 2007 г.).

В одном варианте осуществления препарат по изобретению содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывает IL-13 человека, такое как антитело ABT-308 (Abbott Laboratories) (смотри PCT/US2007/19660).

Примеры белков, которые можно вводить в порошковый препарат, включают антитела или их антигенсвязывающие фрагменты. Примеры различных типов антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые можно использовать по изобретению, включают, но не ограничиваются ими, химерное антитело, человеческое антитело, гуманизированное антитело и доменное антитело (dAb). В одном варианте осуществления антитело, используемое в способах и композициях по изобретению, представляет собой анти-TNF антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, либо анти-IL-12 антитело, либо анти-IL-13 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

Дополнительные примеры антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое можно использовать по изобретению, включают, но не ограничиваются ими, ABT-147 (Abbott Laboratories), ABT-325 (анти-IL-18, Abbott Laboratories), ABT-308 (Abbott Laboratories), ABT-874 (анти-IL-12, Abbott Laboratories), афелимомаб (Fab2 анти-TNF, Abbott Laboratories), хумиру (адалимумаб, Abbott Laboratories), кампат (алемтузумаб), CEA-Scan арцитумомаб (fab-фрагмент), эрбитукс (цетуксимаб), герцептин (трастузумаб), миосцинт (имциромаб пентетат), простасцинт (капромаб пендетид), ремикад (инфликсимаб), РеоПро (абциксимаб), ритуксан (ритуксимаб), симулект (базиликсимаб), синагис (паливизумаб), верлуму (нофетумомаб), ксолаир (омализумаб), зенапакс (даклизумаб), зевалин (ибритумомаб тиуксетан), ортоклон OKT3 (муромонаб-CD3), панорекс (эдреколомаб) и милотарг (гемтузумаб озогамицин).

В одном из альтернативных вариантов белок представляет собой слитый белок, включая, но не ограничиваясь ими, пульмозим (дорназу альфа), ребиф, регранекс (бекаплермин), активазу (алтеплазу), альдуразим (ларонидазу), амевив (алефацепт), аранесп (дарбэпоэтин альфа), бекаплермин концентрат, бетасерон (интерферон бетаb), ботокс (ботулинический токсин типа A), элитек (расбуриказу), элспар (аспарагиназу), эпоген (эпоэтин альфа), энбрель (этанерцепт), фабразим (агальзидазу бета), инферген (интерферон альфакон-1), интрон A (интерферон альфа-2a), кинерет (анакинру), миоблок (ботулинический токсин типа B), невласту (пегфилграстим), ньюмегу (опрелвекин), нейпоген (филграстим), онтак (денилейкин дифтитокс), пегасис (пегинтерферон альфаa), пролейкин (алдеслейкин), пульмозим (дорназу альфа), ребиф (интерферон бета-1a), регранекс (бекаплермин), ретавазу (ретеплазу), роферон-A (интерферон альфа-2), ТНКазу (тенектеплазу) и ксигрис (дротрекогин альфа).

Другие примеры белков, которые можно использовать в способах и композициях, описанных в данном документе, включают белки млекопитающих, включая полученные

Стр.: 25 RU 2 537 139 C2

из них рекомбинантные белки, такие как, например, гормон роста, в том числе гормон роста человека и гормон роста крупного рогатого скота; фактор, высвобождающий гормон роста; паратиреоидный гормон; тиреотропный гормон; липопротеины; -1антитрипсин; А-цепь инсулина; B-цепь инсулина; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания крови, такие как фактор VIIIC, фактор IX, тканевой фактор и фактор фон Виллебранда;

факторы, препятствующие свертыванию крови, такие как белок C; предсердный натрийуретический фактор; легочный сурфактант; активатор плазминогена, такой как урокиназа или тканевой активатор плазминогена (t-PA); бомбазин; тромбин; фактор некроза опухолей- и, энкефалиназа, RANTES (регулируемый при активации, обычно экспрессируемый и секретируемый T-клетками); человеческий воспалительный белок макрофагов (MIP-1-); сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин; мюллерова ингибирующая субстанция; A-цепь релаксина; B-цепь релаксина;

прорелаксин; гонадотропин-ассоциированный пептид мыши; ДНКаза; ингибин; активин;

фактор роста эндотелия сосудов (VEGF); рецепторы гормонов или факторов роста;

интегрин; белок A или D; ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, такой как костный нейротрофический фактор (BDNF), нейротрофин-3, -4, -5 или -6 (NT-3, NTNT-5 или NT-6), или фактор роста нервов, такой как NGF-; тромбоцитарный фактор роста (PDGF); фактор роста фибробластов, такой как aFGF и bFGF; эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF), такой как TGF- и TGFв том числе TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4 или TGF-5; инсулиноподобный фактор роста-I и -II (IGF-I и IGF-II); дез(1-3)-IGF-I (IGF-I головного мозга); белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста; белки CD, такие как CD3, CD4, CD8, CD19 и CD20;

эритропоэтин (EPO); тромбопоэтин (TPO); остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины;

костный морфогенетический белок (BMP); фактор роста и дифференцировки, интерферон, такой как интерферон-, - и -; колониестимулирующие факторы (CSF), например, M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (IL), например, от IL-1 до IL-10;

супероксиддисмутаза; Т-клеточные рецепторы; поверхностные мембранные белки;

стимулятор гемолиза (DAF); вирусный антиген, такой как, например, часть оболочки СПИД; транспортные белки; «хоминг»-рецепторы; адрессины; регуляторные белки;

иммуноадгезины; антитела, а также биологически активные фрагменты или варианты любого из вышеперечисленных полипептидов.

Поликлональные антитела Поликлональные антитела обычно означают смесь антител, которые специфичны для определенного антигена, но связываются с различными эпитопами данного антигена.

Продукцию поликлональных антител, как правило, вызывают у животных путем многократных подкожных (sc) или внутрибрюшинных (ip) инъекций соответствующего антигена и адъюванта. Может оказаться полезным конъюгировать соответствующий антиген с белком, который является иммуногенным для видов животных, подлежащих иммунизации (например, гемоцианин лимфы улитки, сывороточный альбумин, бычий тиреоглобулин или соевый ингибитор трипсина), при помощи бифункционального или дериватизирующего средства, например, сложного эфира малеимидобензоилсульфосукцинимида (конъюгация через остатки цистеина), Nгидроксисукцинимида (через остатки лизина), глютаральдегида, янтарного ангидрида, SOCl2 или R1NCNR, где R и R1 представляют собой разные алкильные группы. Способы получения поликлональных антител известны в данной области и описаны, например, в Antibodies: A Laboratory Manual, Lane and Harlow (1988), включенном в данный документ посредством ссылки.

–  –  –

Моноклональные антитела Термин «моноклональное антитело», используемый в данном документе, предназначен для обозначения антитела, полученного из гибридомы (например, антитела, секретируемого гибридомой, полученной по гибридомной технологии, такой как стандартный метод гибридом Келера и Мильштейна). Например, моноклональные антитела можно получать методом гибридом, впервые описанным Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), либо можно получать методами рекомбинантной ДНК (патент США № 4816567). Таким образом, полученное из гибридомы антитело с двойной специфичностью по изобретению по-прежнему называется моноклональным антителом, хотя оно обладает антигенной специфичностью для более чем одного антигена.

Моноклональные антитела получают из популяции в основном гомогенных антител, то есть отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных естественных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Таким образом, определение «моноклональное» указывает на характерную особенность антитела, как не являющегося смесью отельных антител.

В дополнительном варианте осуществления антитела можно выделять из фаговых библиотек антител, полученных с помощью методов, описанных в McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol.

Biol., 222: 581-597 (1991), где описано выделение мышиных и человеческих антител, соответственно, при помощи фаговых библиотек. В последующих публикациях описано получение высокоаффинных (нМ диапазон) человеческих антител методом перетасовки цепей (Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)), а также комбинаторной инфекции и in vivo рекомбинации в качестве стратегии для конструирования очень больших фаговых библиотек (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). Таким образом, эти методы выделения моноклональных антител являются приемлемой альтернативой традиционным гибридомным методам получения моноклональных антител.

Антитела и фрагменты антител также можно выделять из дрожжей и других эукариотических клеток с помощью экспрессионных библиотек, как описано в патентах США №№ 6423538, 6696251, 6699658, 6300065, 6399763 и 6114147. Эукариотические клетки можно генетически изменять для экспрессии белков библиотеки, включая белки из комбинаторных библиотек антител, для экспонирования на клеточной поверхности, что позволяет отбирать конкретные клетки, содержащие библиотечные клоны для антител с аффинностью для выбора молекул-мишеней. После извлечения из выделенной клетки, библиотечный клон, кодирующий интересующее антитело, можно масштабно экспрессировать в подходящей линии клеток млекопитающих.

Дополнительные методы разработки интересующих антител включают скрининг в бесклеточной среде при помощи технологии дисплея нуклеиновых кислот, как описано в патентах США №№ 7195880, 6951725, 7078197, 7022479, 6518018, 7125669, 6846655, 6281344, 6207446, 6214553, 6258558, 6261804, 6429300, 6489116, 6436665, 6537749, 6602685, 6623926, 6416950, 6660473, 6312927, 5922545 и 6348315. Данные методы можно использовать, чтобы транскрибировать белок с нуклеиновой кислоты in vitro таким образом, что белок является физически ассоциированным или связанным с нуклеиновой кислотой, от которой он происходит. При отборе экспрессированного белка с помощью молекулы-мишени, нуклеиновая кислота, которая кодирует данный белок, также отбирается. В одном варианте метода скрининга в бесклеточной среде последовательности антител, выделенные из клеток иммунной системы, можно выделять и применять метод частично рандомизированного мутагенеза полимеразной цепной

Стр.: 27 RU 2 537 139 C2

реакцией для увеличения разнообразия антител. Эти частично рандомизированные гены антител затем экспрессируются в бесклеточной системе, с одновременной физической ассоциацией, создаваемой между нуклеиновой кислотой и антителом.

ДНК также можно модифицировать, например, заменяя кодирующими последовательностями константных доменов тяжелой и легкой цепей человека гомологичные мышиные последовательности (патент США № 4816567, Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851 (1984)), либо ковалентно присоединяя к кодирующей последовательности иммуноглобулина всю или часть кодирующей последовательности для неиммуноглобулинового полипептида.

Как правило, такими неиммуноглобулиновыми полипептидами заменяют константные домены антитела, или ими заменяют вариабельные домены одного антигенсвязывающего центра антитела, чтобы создать химерное бивалентное антитело, содержащее один антигенсвязывающий центр, обладающий специфичностью для антигена, и другой антигенсвязывающий центр, обладающий специфичностью для другого антигена.

Химерные или гибридные антитела также можно получать in vitro, используя известные методы синтетической белковой химии, включая те, в которых используют перекрестно-сшивающие реагенты. Например, можно сконструировать иммунотоксины при помощи дисульфид-обменной реакции или путем образования тиоэфирной связи.

Примеры подходящих реагентов для этой цели включают иминотиолат и метил-4меркаптобутиримидат.

Гуманизированные антитела Способы гуманизации антител, отличных от человеческих, хорошо известны в данной области. Как правило, гуманизированное антитело имеет один или более аминокислотных остатков, введенных в него из источника, который не является человеком. Данные аминокислотные остатки, отличные от человеческих, часто называют «импортированными» остатками, которые обычно берут из «импортированного»

вариабельного домена. Гуманизацию можно в основном проводить в соответствии с методом Winter и соавторов (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986), Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988), Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), заменяя CDRs или последовательностями CDR, отличными от человеческих (например, последовательностями грызунов), соответствующие последовательности человеческого антитела. Соответственно, такие «гуманизированные» антитела являются химерными антителами (патент США № 4816567), где существенно меньше, чем интактный, человеческий вариабельный домен заменен соответствующей последовательностью из видов, отличных от человека. На практике, гуманизированные антитела, как правило, являются человеческими антителами, в которых некоторые остатки CDR и, возможно, некоторые каркасные (FR) остатки заменены остатками из аналогичных сайтов в антителах грызунов. Дополнительные ссылки, описывающие процесс гуманизации, включают Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993), Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992), Presta et al., J. Immunol., 151:

2623 (1993), каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки.

Человеческие антитела Альтернативно, теперь возможно получать трансгенных животных (например, мышей), которые способны при иммунизации производить полный репертуар человеческих антител при отсутствии эндогенной продукции иммуноглобулинов.

Например, описано, что гомозиготная делеция гена соединительной области (JH) тяжелой цепи антитела у мышей-химер и мышей-мутантов зародышевой линии приводит к

Стр.: 28 RU 2 537 139 C2

полному ингибированию эндогенной продукции антител. Перенос совокупности генов иммуноглобулинов зародышевой линии человека таким мышам-мутантам зародышевой линии приведет к продукции человеческих антител при стимуляции антигеном. Смотри, например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993), Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993), Bruggermann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993). Человеческие антитела можно также получать из библиотеки фагового дисплея (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991), Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)).

Биспецифические антитела Биспецифические антитела (BsAb) представляют собой антитела, которые обладают специфичностями связывания по меньшей мере для двух отдельных эпитопов. Такие антитела можно получать из полноразмерных антител или фрагментов антител (например, биспецифические антитела F(ab')2).

Способы получения биспецифических антител известны в данной области.

Традиционное получение полноразмерных биспецифических антител основано на 15 совместной экспрессии двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулинов, где две цепи имеют различные специфичности (Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)).

Вследствие случайного ассортимента тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, данные гибридомы (квадрогибридомы) продуцируют потенциальную смесь 10 различных молекул антитела, из которых только одна обладает правильной биспецифической 20 структурой. Очистка правильной молекулы, которую обычно выполняют методом аффинной хроматографии, является довольно трудоемкой, а выход продукта невысоким.

Подобные процедуры описаны в WO 93/08829 и в Traunecker el al., EMBO J., 10: 3655Согласно другому подходу, проводят слияние вариабельных доменов антител, 25 обладающих нужными специфичностями связывания (центры связывания антителоантиген), с последовательностями константных доменов иммуноглобулинов.

Предпочтительно слияние проводят с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим по меньшей мере часть шарнирных областей CH2 и CH3. Предпочтительно, чтобы первая константная область тяжелой цепи (CH1), содержащая сайт, необходимый для связывания легкой цепи, присутствовала по меньшей мере в одном из слитых продуктов. ДНК, кодирующие слитые продукты тяжелой цепи иммуноглобулинов, и, при необходимости, легкой цепи иммуноглобулинов, встраивают в отдельные экспрессионные векторы и совместно трансфицируют в подходящий организм-хозяина. Это обеспечивает большую гибкость в регулировании взаимных пропорций трех полипептидных фрагментов в вариантах осуществления, когда неравное соотношение трех полипептидных цепей, используемых в конструкции, обеспечивает оптимальный выход продукта. Однако возможно встраивать кодирующие последовательности для двух или всех трех полипептидных цепей в один экспрессионный вектор, если экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях приводит к высоким выходам, либо когда соотношения не имеют большого значения.

В предпочтительном варианте осуществления данного подхода биспецифические антитела составлены из тяжелой цепи гибридного иммуноглобулина с первой специфичностью связывания на одном плече и пары тяжелая цепь-легкая цепь гибридного иммуноглобулина (обеспечивающей вторую специфичность связывания) на другом плече. Установлено, что такая ассиметричная структура облегчает отделение нужного биспецифического соединения от нежелательных сочетаний цепей

Стр.: 29 RU 2 537 139 C2

иммуноглобулина, поскольку присутствие легкой цепи иммуноглобулина только на одной половине биспецифической молекулы облегчает разделение. Данный подход раскрыт в WO 94/04690, дата публикации 3 марта 1994 г. Для более подробной информации о получении биспецифических антител смотри, например, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).

Биспецифические антитела включают перекрестно-сшитые или «гетероконъюгированные» антитела. Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть связано с авидином, а другое с биотином. Такие антитела, например, были предложены для нацеливания клеток иммунной системы на нежелательные клетки (патент США № 4676980), а также для лечения ВИЧ-инфекции (WO 91/00360, WO 92/ 200373 и EP 03089). Гетероконъюгированные антитела можно получать с помощью любого удобного метода перекрестной сшивки. Подходящие перекрестно-сшивающие реагенты хорошо известны в данной области и раскрыты в патенте США № 4676980, вместе с целым рядом методов перекрестной сшивки.

Методы создания биспецифических антител из фрагментов антител также описаны в литературе. Следующие методы также можно использовать для производства бивалентных фрагментов антитела, которые не обязательно являются биспецифическими. Например, Fab'-фрагменты, выделенные из E. Coli, можно химически соединять in vitro, получая бивалентные антитела. Смотри Shalaby et al.,J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992).

Описаны также различные методы получения и выделения бивалентных фрагментов антитела непосредственно из культуры рекомбинантных клеток. Например, бивалентные гетеродимеры были получены при помощи лейциновых застежек. Kostelny et al., J.

Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Пептиды с лейциновыми застежками из белков Fos и Jun были присоединены к Fab'-фрагментам двух различных антител путем слияния генов. Гомодимеры антитела были восстановлены в шарнирной области с образованием мономеров, а затем повторно окислены с образованием гетеродимеров антитела. Метод «диател», описанный Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) предоставляет альтернативный механизм для получения биспецифических/бивалентных фрагментов антител. Фрагменты включают вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) линкером, который является слишком коротким, чтобы допустить спаривание между двумя доменами на одной и той же цепи. Соответственно, VH и VL домены одного фрагмента принудительно образуют пары с комплементарными VL и VH доменами другого фрагмента, тем самым создавая два антигенсвязывающих центра. Сообщали также о другой стратегии получения биспецифических/бивалентных фрагментов антител путем использования одноцепочечных Fv (sFv) димеров. Смотри Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994).

В одном варианте осуществления препарат по изобретению содержит антитело, которое является биспецифическим для IL-1 (включая IL-1 и IL-1). Примеры и методы получения биспецифических антител к IL-1 можно найти в WO 08/082651, дата публикации 10 июля 2008 г.

Связывающие белки с двойными вариабельными доменами (DVD) Связывающие белки с двойными вариабельными доменами (DVD) представляют собой белки, которые содержат два или более антигенсвязывающих центров и являются тетравалентными или мультивалентными связывающими белками. DVD могут быть моноспецифическими, то есть способными связывать один антиген, или мультиспецифическими, то есть способными связывать два или более антигенов.

Стр.: 30 RU 2 537 139 C2

Связывающие белки с DVD, содержащие два полипептида DVD тяжелой цепи и два полипептида DVD легкой цепи, называют DVD Ig™. Каждая половина DVD Ig содержит полипептид DVD тяжелой цепи и полипептид DVD легкой цепи и два антигенсвязывающих центра. Каждый центр связывания включает вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, в общей сложности с шестью CDR, вовлеченными в связывание антигена, на антигенсвязывающий центр. В некоторых вариантах осуществления DVD может включать любой из DVD, раскрытых в патентной публикации США № 20070071675 авторов Wu et al., опубликованной 29 марта 2007 г., которая включена в данный документ посредством ссылки.

Молекулы DVD-Ig полезны в качестве терапевтических средств для одновременного блокирования двух различных мишеней с целью повышения эффективности/безопасности и/или для увеличения охвата пациентов. Такие мишени могут включать растворимые мишени (IL-13 и TNF) и мишени - рецепторы клеточной поверхности (VEGFR и EGFR).

Их также можно использовать, чтобы индуцировать перенаправленную цитотоксичность между опухолевыми клетками и T-клетками (Her2 и CD3) для лечения рака, либо между аутореактивными клетками и эффекторными клетками при аутоиммунных реакциях/ трансплантации, либо между любой клеткой-мишенью и эффекторной клеткой для элиминации болезнетворных клеток при той или иной болезни.

Кроме того, DVD-Ig можно использовать, чтобы вызвать кластеризацию и активацию рецепторов, когда оно разработано для нацеливания на два различных эпитопа на одном и том же рецепторе. Это может иметь преимущество в создании агонистических и антагонистических анти-GPCR терапевтических средств. В данном случае DVD-Ig можно использовать для нацеливания на два различных эпитопа на одной клетке для кластеризации/передачи сигнала (две молекулы клеточной поверхности) или передачи сигнала (на одной молекуле). Аналогичным образом, молекулу DVD-Ig можно сконструировать для запуска лигирования CTLA-4 и отрицательного сигнала путем нацеливания на два различных эпитопа (или две копии одного и того же эпитопа) внеклеточного домена CTLA4, что приводит к подавлению иммунного ответа.

Аналогичным образом, DVD-Ig может быть нацелено на два различных члена рецепторного комплекса поверхности клетки (например, IL-12R альфа и бета). Кроме того, DVD-Ig может быть нацелено на CR1 и растворимый белок/патоген для стимулирования быстрого выведения целевого растворимого белка/патогена.

Кроме того, DVD-Ig по изобретению можно использовать для тканеспецифической доставки (нацеленной на тканевой маркер и медиатор болезни для усиления местной PK, и, следовательно, более высокой эффективности и/или меньшей токсичности), в том числе внутриклеточной доставки (нацеленной на интернализирующий рецептор и внутриклеточную молекулу), доставки внутрь мозга (нацеленной на рецептор трансферрина и медиатор заболевания ЦНС для пересечения гематоэнцефалического барьера). DVD-Ig может также служить белком-носителем для доставки антигена к определенному месту путем связывания с не-нейтрализующим эпитопом данного антигена, а также для повышения времени полужизни антигена.

Данное изобретение относится к стабильным порошковым композициям, включающим любой подходящий белок, включая те, что описаны в данном документе, и полученным, как описано в данном документе. Например, порошок может включать белок или пептид (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент) и эксципиент, где композиция содержит менее чем примерно 6% остаточной влаги. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит менее чем примерно 5,5%, 5%, 4,4%, 4%, 3,5% или 3% остаточной влаги. В некоторых вариантах осуществления

Стр.: 31 RU 2 537 139 C2

композиция содержит менее чем 2% или 1% остаточной влаги. В других вариантах осуществления композиция содержит остаточную влагу в диапазоне, ограниченном приведенными выше значениями, например, примерно от 4% до 6%, примерно от 4,5% до 5,5% или примерно от 3% до 5% остаточной влаги. В некоторых вариантах осуществления содержание остаточной влаги полученной порошковой композиции составляет от примерно 1% до примерно 3%, примерно от 1,5% до 2,5%, от примерно 1,4% до примерно 2%, примерно от 4% до 6% или от примерно 4,5% до примерно 5%.

В других вариантах осуществления порошковая композиция содержит примерно 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5% или 7% остаточной влаги.

В некоторых вариантах осуществления белок сохраняет свою биологическую активность в течение желаемого периода времени. В одном варианте осуществления порошок стабилен при температуре и влажности окружающей среды в течение по меньшей мере 3 месяцев. В некоторых вариантах осуществления порошок стабилен в течение по меньшей мере 6 месяцев, 9 месяцев, 1 года, 2 лет, 3 лет или 5 лет при температуре и влажности окружающей среды. В других вариантах осуществления порошок стабилен при 40°C в течение по меньшей мере 3 месяцев. В дополнительных вариантах осуществления порошок стабилен при 40°C в течение по меньшей мере 3 месяцев, 6 месяцев, 9 месяцев, 1 года, 2 лет или 5 лет. В других дополнительных вариантах осуществления порошок стабилен при 40°C и влажности окружающей среды в течение по меньшей мере 3 месяцев, 6 месяцев, 9 месяцев, 1 года, 2 лет или 5 лет.

Порошковые композиции по изобретению и/или фармацевтические композиции, включающие порошковые композиции, могут содержать эксципиент. Подходящие эксципиенты включают, но не ограничиваются ими, трегалозу, сахарозу, сорбит, полиэтиленгликоль, по меньшей мере одну аминокислоту, гистидин, аланин, аргинин, глицин или их смесь. Способ может дополнительно включать добавление кислого компонента, антиоксиданта и/или модификатора тоничности.

В некоторых вариантах осуществления композиция имеет массовое соотношение эксципиента и антитела или его антигенсвязывающего фрагмента от примерно 0,27:1,0 до примерно 2,8:1,0; от примерно 0,27:1,0 до примерно 1,4:1,0; от примерно 0,27:1,0 до примерно 0,7:1,0 или примерно 0,7:1,0, и эксципиент представляет собой трегалозу или сахарозу. В других вариантах осуществления композиция имеет массовое соотношение эксципиента и антитела или его антигенсвязывающего фрагмента от примерно 0,27:1,0 до примерно 2,8:1,0, от примерно 0,27:1,0 до примерно 1,4:1,0, от примерно 0,27:1,0 до примерно 0,7:1,0, примерно 0,7:1,0 или примерно 0,35:1, и эксципиент представляет собой сорбит.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим препаратам, которые содержат эффективное количество порошков, описанных в данном документе.

Фармацевтически приемлемый носитель может быть любым носителем, приемлемым для парентерального, перорального, энтерального и/или местного применения. Носитель может быть твердым, полутвердым или жидким (например, вода или органическая жидкость), либо их сочетаниями.

Порошок можно смешивать (например, растворять или погружать) с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтически приемлемый носитель может быть, например, приемлемым для парентерального введения, и может включать, например, воду. Способ может дополнительно включать добавление одного или нескольких кислых компонентов, антиоксидантов и/или модификаторов тоничности к фармацевтической композиции. Дополнительно или альтернативно, к фармацевтическим композициям по изобретению можно добавлять подходящие добавки, например, буферные растворы,

Стр.: 32 RU 2 537 139 C2

модификаторы вязкости, ароматизаторы, красители и так далее.

К порошковым фармацевтическим композициям можно применять экструзию расплава, прессование или иную обработку для создания, например, таблеток или других твердых или полутвердых композиций. Порошок можно покрывать, например, полимерами, такими как PLGA, для создания фармацевтической композиции с замедленным высвобождением или отсроченным высвобождением. Дополнительно или альтернативно, композиции можно инкапсулировать или покрывать, например, энтеросолюбильным покрытием. Покрытия и/или эксципиенты можно использовать, например, для защиты лекарственного средства от преципитации, денатурации или окисления органическими растворителями, такими как полиэтиленгликоль (например, PEG 400), этанол, DMSO, NMP, ледяная уксусная кислота, или тому подобное.

Жидкие композиции, например, водные композиции, также предусмотрены. Такие композиции могут подходить, например, для перорального или внутривенного введения и могут содержать любой подходящий эксципиент или добавку, такую как модификатор тоничности или буферные растворы. В некоторых вариантах осуществления жидкая фармацевтическая композиция имеет низкое процентное содержание белковых агрегатов, невзирая на высокую концентрацию водного белкового препарата. В одном варианте осуществления водная композиция содержит воду и белок, например, антитела, в высокой концентрации, который содержит менее чем примерно 5% белковых агрегатов, даже в отсутствие поверхностно-активного вещества или другого типа эксципиента. В одном варианте осуществления композиция содержит не более чем примерно 7,3% агрегированного белка, композиция содержит не более чем примерно 5% агрегированного белка, композиция содержит не более чем примерно 4% агрегированного белка, композиция содержит не более чем примерно 3% агрегированного белка, композиция содержит не более чем примерно 2% агрегированного белка, или композиция содержит не более чем примерно 1% агрегированного белка. В одном варианте осуществления композиция содержит по меньшей мере примерно 92%, по меньшей мере примерно 93%, по меньшей мере примерно 94%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 97%, по меньшей мере примерно 98% или по меньшей мере примерно 99% мономера белка. Диапазоны, промежуточные для приведенных выше концентраций, например, по меньшей мере примерно 98,6% мономера белка, не более чем примерно 4,2% агрегированного белка, также предназначены являться частью данного изобретения. Кроме того, диапазоны значений при использовании сочетания любых из приведенных выше значений в качестве верхней и/или нижней границ также предусмотрены для включения.

IV. Способы применения изобретения Композиции по изобретению можно использовать как для терапевтических целей, то есть in vivo, так и в качестве реагентов для in vitro или in situ применения. Как описано и проиллюстрировано на примерах в данном документе, можно использовать распылительную сушку для получения сухих порошковых белков с целью применения в качестве исходных материалов для разработки/производства, например: (a) энтерального препарата ABT-874 для лечения язвенного колита, (b) препарата адалимумаба местного применения для лечения диабетических язв и (c) легочную лекарственную форму ABT-308 для лечения астмы. Кроме того, высушенные распылением антитела можно использовать в методе экструзии расплава MELTREX, поскольку вполне вероятно, что моноклональное антитело (мАТ) (mAb), заключенное в матрицу стеклообразных эксципиентов (например, трегалозу), обладает большей

Стр.: 33 RU 2 537 139 C2

устойчивостью к тепловому развертыванию/денатурации. Это также может создать возможности для разработки новых твердых белковых лекарственных форм, например, для перорального введения белков.

Терапевтическое применение Способы по изобретению можно также использовать для получения фармацевтических композиций, обладающих характеристиками, которые полезны для терапевтического применения. Фармацевтические композиции, в том числе жидкие и твердые композиции, можно использовать в качестве фармацевтической композиции или препарата для лечения нарушения у субъекта.

Композиции по изобретению можно использовать для лечения любого нарушения, для которого терапевтический белок, пептид, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент являются подходящими для лечения. «Нарушение» представляет собой любое состояние, которое улучшается в результате лечения антителом. Сюда относятся хронические и острые нарушения или заболевания, включая те патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающее к рассматриваемому нарушению.

В случае анти-TNF антитела, терапевтически эффективное количество антитела можно вводить для лечения аутоиммунного заболевания, такого как ревматоидный артрит, кишечные расстройства, например, болезнь Крона, спондилоартропатия, например, анкилозирующий спондилоартрит, или заболевание кожи, например, псориаз. В случае анти-IL-12 антитела, терапевтически эффективное количество антитела можно вводить для лечения неврологического нарушения, такого как рассеянный склероз, или заболевания кожи, такого как псориаз. Другие примеры нарушений, для лечения которых можно использовать композиции по изобретению, включают рак, в том числе рак молочной железы, лейкемию, лимфому и рак толстой кишки.

Термин «субъект» должен включать живые организмы, например, прокариоты и эукариоты. Примеры субъектов включают млекопитающих, например, людей, собак, коров, лошадей, свиней, овец, коз, кошек, мышей, кроликов, крыс и трансгенных животных, отличных от человека. В определенных вариантах осуществления изобретения субъект является человеком.

Термин «лечение» означает как терапевтическое лечение, так и профилактические и превентивные меры. Нуждающиеся в лечении включают тех, которые уже имеют заболевание, а также тех, у которых заболевание должно быть предотвращено.

Водные или твердые композиции можно вводить млекопитающему, включая человека, нуждающемуся в лечении, известными способами введения. Примеры способов введения включают внутривенное введение, такое как болюсное введение или путем непрерывной инфузии на протяжении определенного периода времени, внутримышечное, внутрибрюшинное, интрацереброспинальное, подкожное, внутрисуставное, интрасиновиальное, интратекальное, внутрикожное, трансдермальное, пероральное, местное или ингаляционное введение.

В одном варианте осуществления композицию вводят млекопитающему путем подкожного введения. Для этих целей композицию можно вводить, используя шприц, а также другие устройства, в том числе инъекционные устройства (например, устройства Inject-ease и Genject); инжекторы-ручки (например, GenPen); безыгольные устройства (например, MediJector и BioJector) и подкожные системы доставки с помощью пластырей.

Изобретение также охватывает устройства доставки, в которых размещена композиция. Примеры таких устройств включают, но не ограничиваются ими, шприц, ручку, имплантат и пластырь. Пример аутоинъекционной ручки описан в патентной заявке США № 11/824516, зарегистрированной 29 июня 2007 г.

Стр.: 34 RU 2 537 139 C2

Соответствующая дозировка («терапевтически эффективное количество») белка, пептида, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента будет зависеть, например, от состояния, подлежащего лечению, тяжести и течения состояния, вводят ли его с превентивной или терапевтической целью, предшествующей терапии, истории болезни пациента и его реакции на белок, типа используемого белка, а также от усмотрения лечащего врача. Композиции по изобретению надлежащим образом вводят пациенту за один раз или на протяжении ряда процедур, и их можно вводить пациенту с момента постановки диагноза и далее. Композиции можно вводить в качестве единственного лечения или в сочетании с другими лекарственными средствами или методами лечения, пригодными для лечения рассматриваемого состояния.

В одном варианте осуществления композиции по настоящему изобретению, например, те, которые включают афелимомаб и/или любое другое подходящее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, используют терапевтически. В одном варианте осуществления композиции представляют собой фармацевтические композиции для использования в лечении сепсиса.

Сепсис, фактор некроза опухолей- (TNF-) и афелимомаб Сепсис определяют как системный воспалительный ответ на инфекцию. Инфекция может быть, например, вирусной, бактериальной, грибковой или паразитарной. Сепсис в конечном итоге приводит к активации иммунокомпетентных клеток и системному воспалительному ответу, связанному с высвобождением многих цитокинов (TNF-, IL-1 и так далее). Существуют различные стадии/виды сепсиса, как определено ACCP (Американской коллегией врачей - специалистов по заболеваниям грудной клетки) (American College of Chest Physicians): SIRS (синдром системного воспалительного ответа) (системная воспалительная реакция различного генеза (инфекция, эритема и так далее), сепсис (SIRS, вызванный инфекцией), тяжелый сепсис (сепсис с отказом/дисфункцией органов) и септический шок (сепсис с шоком)). Для диагностики этих видов сепсиса должны быть соблюдены различные критерии.

Первичный возникающий иммунный ответ организуется и усиливается различными вторичными медиаторами. Организм не в состоянии ограничивать воспаление местом его возникновения, (главным образом в легких или в системе кровообращения). Могут быть затронуты различные органы, что оказывает сильное влияние на некоторые функции организма. Вследствие этого, возможные признаки сепсиса включают гипертермию, тахипноэ, тахикардию, гипотонию и спутанность сознания. Из-за целого ряда показателей сепсис очень трудно диагностировать, что вносит вклад в высокие показатели смертности среди пациентов с сепсисом.

Известны различные лекарственные препараты для лечения больных сепсисом, в том числе дротрекогин (активированный белок C) и антитромбин III для блокирования свертывания крови, и кортизон (в низких дозах) для уменьшения воспаления. Bloos et al., Aktuelle Ernhrungsmedizin, 28: 186-190 (2003). Поскольку TNF- является одним из основных медиаторов сепсиса, одним из подходов к лечению сепсиса является блокирование TNF- для устранения его эффектов. Локальное высвобождение TNFувеличивает приток крови и проницаемость сосудов. Это создает условия для притока в инфицированную ткань жидкостей, клеток и белков, которые участвуют в иммунной защите организма. Для предотвращения распространения инфекции в кровь в малых сосудах позже образуются сгустки, и жидкость просачивается в лимфатические узлы, где начинает развиваться адаптивный иммунный ответ. При системных инфекциях TNF- работает аналогичным образом, вызывая шок и диссеминированное внутрисосудистое свертывание. Результатами являются истощение факторов

Стр.: 35 RU 2 537 139 C2

свертывания крови, постоянное кровотечение и полиорганная недостаточность. Janeway et al., Immunobiology (Garland Publishing, 1994). Блокирование TNF- может быть достигнуто парентеральным введением анти-TNF- антител. Благодаря конструированию фрагмента антитела афелимомаба должно быть достигнуто лучшее проникновение в ткани в сочетании с меньшей проблемой иммуногенности.



Pages:   || 2 |


Похожие работы:

«• ВОРОНЕЖСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ • им. Н.Н. БУРДЕНКО • КАФЕДРА ПАТОЛОГИЧЕСКОЙ АНАТОМИИ Болезни сосудов Часть 1 Профессор Даниленко В.И. АРТЕРИАЛЬНЫЕ ГИПЕРТЕНЗИИ повышение давления крови от устья аорты до артериол включительно. В России свыше 40 млн челове...»

«mini-doctor.com Инструкция Форсаж таблетки жевательные по 50 мг №4 (2х2) ВНИМАНИЕ! Вся информация взята из открытых источников и предоставляется исключительно в ознакомительных целях. Форсаж таблетки жевательные по 50 мг №4 (2х2) Действующее вещество: Силденафил Лекарственная форма: Таблетки Фармакотерапевтическая гру...»

«Зарегистрировано в Минюсте РФ 24 марта 2011 г. N 20275 МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПРИКАЗ от 24 декабря 2010 г. N 2057 ОБ УТВЕРЖДЕНИИ И ВВЕДЕНИИ В ДЕЙСТВИЕ ФЕДЕРАЛЬНОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ОБРАЗОВАТЕЛЬНОГО СТАНДАРТА ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ПО НАПРАВЛЕНИЮ ПОДГОТОВКИ (...»

«№ 5 2011 г. 14.00.00 медицинские и фармацевтические науки УДК 615.322-035.85 ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФИРНОГО МАСЛА ИЗ НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ fILIPENDULA ULMARIA (L.) MAXIM М.Ю. Круглова1, М.А. Ханина1, Д.Л. Макарова1, Д.В. До...»

«Утверждено Правлением ЗАО "АБСОЛЮТБАНК" Протокол № 50 от 17.07.2015 в редакции Изменения № 1, утвержденного протоколом Правления ЗАО "АБСОЛЮТБАНК" от 14.08.2015 № 56; Изменения № 2, утвержденного протоколом Правления ЗАО "АБСОЛЮТБАНК" от 18.09.2015 № 62; Изменения № 3, утвержденного протоколом Правле...»

«ГБОУ ВПО РОССИЙСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ им Н.И.Пирогова МИНЗДРАВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КАФЕДРА ПАТОФИЗИОЛОГИИ Патофизиология углеводного обмена. Сахарный диабет. М...»

«Межрегиональная общественная организация содействия развитию неонатологии "Ассоциация неонатологов" Клинические рекомендации по диагностике и лечению гемолитической болезни новорожденных Рабочая группа: Дегт...»

«РОССИЙСКОЕ ОБЩЕСТВО ДЕРМАТОВЕНЕРОЛОГОВ И КОСМЕТОЛОГОВ ФЕДЕРАЛЬНЫЕ КЛИНИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ВЕДЕНИЮ БОЛЬНЫХ ВРОЖДЕННЫМ БУЛЛЕЗНЫМ ЭПИДЕРМОЛИЗОМ Москва 2015 Персональный состав рабочей группы по подготовке федеральных клинических рекомендаций по профилю Дерматовенерология, раздел "Врожде...»

«АДМИНИСТРАЦИЯ ГОРОДА СМОЛЕНСКА ПОСТАНОВЛЕНИЕ от 22 апреля 2014 г. N 730-адм ОБ УТВЕРЖДЕНИИ ПОРЯДКА ПРИНЯТИЯ РЕШЕНИЙ О РАЗРАБОТКЕ МУНИЦИПАЛЬНЫХ ПРОГРАММ И ВЕДОМСТВЕННЫХ ЦЕЛЕВЫХ ПРОГРАММ, ИХ...»

«Сравнительный анализ главы 34 НК РФ и Федерального закона N 212-ФЗ О страховых взносах в Пенсионный фонд Российской Федерации, Фонд социального страхования Российской Федерации, Федеральный фонд обязательного медицинского страхования Ранее действовавший НПА Новый НПА Примечание эксперта Администри...»

«ЭСПРЕСС-АНАЛИЗ РЫНКА УСЛУГ ПЛАТНОЙ МЕДИЦИНЫ (ГИНЕКОЛОГИЯ И УРОЛОГИЯ) ДЕМОНСТРАЦИОННАЯ ВЕРСИЯ Дата выпуска отчета: декабрь 2008 г. Данное исследование подготовлено МА Step by Step исключительно в информационных целях. Информация, представленная в исследовании, получена из открытых источников или собрана с помощью маркетинговых ин...»

«ЦЕНТРАЛЬНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ТРАВМАТОЛОГИИ И ОРТОПЕДИИ им. Н.Н. ПРИОРОВА Методическое пособие ПРОГРАММА РЕАБИЛИТАЦИИ ПРИ ПОВРЕЖДЕНИЯХ ХРЯЩЕВЫХ И КАПСУЛЬНО-СВЯЗОЧНЫХ СТРУКТУР КОЛЕННОГО СУСТАВА Цыкунов М.Б.ПРОГРАММА РЕАБИЛИТАЦИИ ПРИ ПОВРЕЖДЕНИЯХ ХРЯЩЕВЫХ И КАПСУЛЬНО-СВЯЗОЧНЫХ СТРУКТУР КОЛЕННОГ...»

«УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ "БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" УДК 616.12-008.331.1-055.1-07 СОРОКИНА Виктория Николаевна МНОГОФАКТОРНАЯ ОЦЕНКА РИСКА РАЗВИТИЯ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ У МУЖЧИН Авторефе...»

«. Рабочая программа учебной дисциплины разработана на основе Федерального государственного образовательного стандарта среднего профессионального образования по специальности 33.02.01 Фармация Организация – разработчик: Медицинский колледж (структурное подразделение) ФГАОУ ВО "КФУ ИМ. В.И. ВЕРНАДСКОГ...»

«МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ "СИМВОЛ НАУКИ" №11-4/2016 ISSN 2410-700Х УДК 616.61-007.42-089 Мамбетов Ж.С., Иманалиев Ч.М. Республиканский Научный Центр урологии при Национальном госпитале Министерства Здравоохранения Кыргызской Р...»

«Зенцова Наталья Игоревна СИСТЕМНАЯ МОДЕЛЬ ПСИХОЛОГИЧЕСКОГО ЭТАПА РЕАБИЛИТАЦИИ БОЛЬНЫХ НАРКОМАНИЕЙ 19.00.04 – Медицинская психология (психологические науки) Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора психологических наук Москва 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования "Московс...»

«ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ СИБИРСКАЯ ЯЗВА Учебное пособие УФА УДК 616.98:579.852.11 (075.8) ББК 55.146.26я7 С 34 Рецензенты: заведующий кафедро...»

«РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ (19) (11) (13) RU 2 529 382 C1 (51) МПК A61B 5/0484 (2006.01) ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ (12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ 2013122589/14, 16.05.2013 (21)(22) Заявка: (72) Автор(ы): Гордеев Сергей Александрович (...»

«МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ СОЮЗ ПЕДИАТРОВ РОССИИ ФЕДЕРАЛЬНЫЕ КЛИНИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОКАЗАНИЮ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ ДЕТЯМ С ОСТРЫМ ОБСТРУКТИВНЫМ (СТЕНОЗИРУЮЩИМ) ЛАРИНГОТРАХЕИТОМ, ЭПИГЛОТТИТОМ Главны...»

«Министерство здравоохранения Российской Федерации Волгоградский государственный медицинский университет Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России Разработка, исследование и маркетин...»

«Управление здравоохранения правительства Еврейской автономной области Областное государственное профессиональное образовательное бюджетное учреждение "Биробиджанский медицинский колледж" РАБОЧАЯ ПРОГРАММА ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО МОДУЛЯ 01 "Диагн...»

«  РОСТ, РАЗВИТИЕ И НЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ТЕЛЯТ В УСЛОВИЯХ ГИПОТЕРМИИ Сулагаев Ф.В., Яковлев С.Г., Семенов В.Г. Резюме В статье отражена проблема внедрения в производство адаптивной технологии выращивания телят из-за отсутствия методов фармакопрофилактики температурного стресса, коррекции адаптогенеза...»








 
2017 www.doc.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные документы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.