WWW.DOC.KNIGI-X.RU
Ѕ≈—ѕЋј“Ќјя  »Ќ“≈–Ќ≈“  Ѕ»ЅЋ»ќ“≈ ј - –азличные документы
 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Ђ—ќ¬–≈ћ≈ЌЌџ≈ ћ≈“ќƒџ ¬џƒ≈Ћ≈Ќ»я,  ”Ћ№“»¬»–ќ¬јЌ»я » »ƒ≈Ќ“»‘» ј÷»» «≈Ћ≈Ќџ’ ¬ќƒќ–ќ—Ћ≈… (CHLOROPHYTA) –ќ——»…— јя ј јƒ≈ћ»я Ќј”  ‘≈ƒ≈–јЋ№Ќќ≈ ј√≈Ќ“—“¬ќ Ќј”„Ќџ’ ќ–√јЌ»«ј÷»… ‘≈ƒ≈–јЋ№Ќќ≈ √ќ—”ƒј–—“¬≈ЌЌќ≈ ...ї

-- [ —траница 1 ] --

ј.ƒ. “емралеева, ≈.¬. ћинчева,

ё.—. Ѕукин, ј.ћ. јндреева

—ќ¬–≈ћ≈ЌЌџ≈ ћ≈“ќƒџ

¬џƒ≈Ћ≈Ќ»я,  ”Ћ№“»¬»–ќ¬јЌ»я

» »ƒ≈Ќ“»‘» ј÷»» «≈Ћ≈Ќџ’

¬ќƒќ–ќ—Ћ≈… (CHLOROPHYTA)

–ќ——»…— јя ј јƒ≈ћ»я Ќј” 

‘≈ƒ≈–јЋ№Ќќ≈ ј√≈Ќ“—“¬ќ Ќј”„Ќџ’ ќ–√јЌ»«ј÷»…

‘≈ƒ≈–јЋ№Ќќ≈ √ќ—”ƒј–—“¬≈ЌЌќ≈ Ѕёƒ∆≈“Ќќ≈ ”„–≈∆ƒ≈Ќ»≈ Ќј” »

»Ќ—“»“”“ ‘»«» ќ-’»ћ»„≈— »’ » Ѕ»ќЋќ√»„≈— »’ ѕ–ќЅЋ≈ћ

ѕќ„¬ќ¬≈ƒ≈Ќ»я –јЌ

‘≈ƒ≈–јЋ№Ќќ≈ √ќ—”ƒј–—“¬≈ЌЌќ≈ Ѕёƒ∆≈“Ќќ≈ ”„–≈∆ƒ≈Ќ»≈ Ќј” »

Ћ»ћЌќЋќ√»„≈— »… »Ќ—“»“”“ —ќ –јЌ

‘≈ƒ≈–јЋ№Ќќ≈ √ќ—”ƒј–—“¬≈ЌЌќ≈ Ѕёƒ∆≈“Ќќ≈ ”„–≈∆ƒ≈Ќ»≈ Ќј” »

»Ќ—“»“”“ Ѕ»ќЋќ√»» ¬Ќ”“–≈ЌЌ»’ ¬ќƒ »ћ. ».ƒ. ѕјѕјЌ»Ќј –јЌ

—ќ¬–≈ћ≈ЌЌџ≈ ћ≈“ќƒџ ¬џƒ≈Ћ≈Ќ»я,

 ”Ћ№“»¬»–ќ¬јЌ»я » »ƒ≈Ќ“»‘» ј÷»»

«≈Ћ≈Ќџ’ ¬ќƒќ–ќ—Ћ≈… (CHLOROPHYTA)

”ƒ  582.263:(58.083+577.21+57.065) ЅЅ  28.591 “-32 ќтветственный редактор: к.б.н. ј.ƒ. “емралеева –ецензенты: д.б.н. ¬.¬. јлешин (»нститут физико-химической биологии имени ј.Ќ. Ѕелозерского ћ√” имени ћ.¬. Ћомоносова) д.б.н. ј.ј. √ончаров (Ѕиолого-почвенный институт ƒ¬ќ –јЌ) “емралеева ј.ƒ., ћинчева ≈.¬., Ѕукин ё.—., јндреева ј.ћ.



—овременные методы выделени€, культивировани€ и идентификации зеленых водорослей (Chlorophyta). Ц  острома:  остромской печатный дом, 2014. Ц 215 с.

ISBN 978-5-91806-016-2 ¬ данной монографии описаны современные методы выделени€, культивировани€ и определени€ зеленых водорослей из различных биотопов. «атрагиваютс€ теоретические вопросы концепции вида у зеленых водорослей, роли традиционных морфологических методов и современных генетических подходов. ѕодробно описана процедура молекул€рно-филогенетического анализа данных в виде протоколов и пошаговых инструкций с конкретными примерами. –екомендуетс€ научным сотрудникам, аспирантам и студентам, интересующимс€ проблемами биоразнообрази€, экологии и молекул€рной систематики зеленых водорослей.

Ѕиблиограф. 252 назв., рис. 69, табл. 25.

©  оллектив авторов, 2014 © ‘отографии зеленых микроводорослей “емралеевой ј.ƒ.

ќ√Ћј¬Ћ≈Ќ»≈

ѕ–≈ƒ»—Ћќ¬»≈

—ѕ»—ќ  —ќ –јў≈Ќ»…

–ј«ƒ≈Ћ I. ¬џƒ≈Ћ≈Ќ»≈ »  ”Ћ№“»¬»–ќ¬јЌ»≈

«≈Ћ≈Ќџ’ ¬ќƒќ–ќ—Ћ≈…

√лава 1. ћетоды сбора и выделени€ зеленых водорослей из природных образцов (ј.ƒ. “емралеева, ≈.¬. ћинчева)

1.1 —бор водорослей из различных сред обитани€ 7 1.1.1 —бор планктонных и бентосных водорослей 7 1.1.2 —бор почвенных и аэрофильных водорослей 11 1.1.3 —бор водорослей из экстремальных местообитаний 13

1.2 ѕолучение накопительных смешанных культур 13 1.2.1 „ашечные культуры со Ђстеклами обрастани€ї 14 1.2.2 ¬одные и водно-почвенные культуры 15 1.2.3 ∆идкие и агаризованные культуры 16 √лава 2. ћетоды получени€ альгологически чистых и аксеничных культур водорослей (ј.

ƒ. “ем

Ц  Ц  Ц

ѕ–≈ƒ»—Ћќ¬»≈

ƒанна€ монографи€ продолжает серию работ, изданных по инициативе ÷ентра коллективного пользовани€ Ђћолекул€рные технологииї (с 2014 г. лаборатории экологической биохимии) »Ѕ¬¬ –јЌ на основе результатов 6-й и 7-й научно-практических школ по проблемам молекул€рной экологии и эволюции. ќна предназначена дл€ научных сотрудников, аспирантов и студентов, интересующихс€ проблемами биоразнообрази€, экологии и молекул€рной систематики зеленых водорослей. ¬ книге затрагиваютс€ теоретические вопросы концепции вида у зеленых водорослей, роли морфологических методов и молекул€рно-генетических подходов, используемых в современной альгологии. ѕодробно описаны практические методы, которые используют авторы, от этапа сбора проб, выделени€ водорослей в культуру до их морфологической и молекул€рно-генетической идентификации. ќсновное внимание уделено основам современной диагностики водорослей, выбору молекул€рных маркеров, протоколам ѕ÷–-анализа, включа€ стадии выделени€ тотальной ƒЌ , амплификации фрагментов генов, электрофоретической детекции ампликонов и подготовки ѕ÷–-продукта к секвенированию. ѕроцедура молекул€рнофилогенетического анализа данных показана на конкретных примерах последовательностей генов зеленых водорослей (18S рƒЌ  и rbcL) с пошаговыми инструкци€ми. ќсвещен как дистанционный подход разделени€ таксонов, так и CBC-подход. ќбъединена в виде приложений информаци€ о культуральных средах дл€ водорослей, используемых праймерах, интернет-ресурсах по альгологическим коллекци€м, базам данных и журналам, программному обеспечению дл€ анализа молекул€рных данных и др. ќсобый акцент сделан на проблемы, возникающие у исследовател€ при использовании современных методов идентификации зеленых водорослей, и пути их решени€.

јвторы выражают искреннюю благодарность своим коллегам (коллективы сотрудников »‘’иЅѕѕ –јЌ, Ћ»Ќ —ќ –јЌ, »Ѕ¬¬ –јЌ) за ценные консультации и советы при подготовке книги, а также Ќ»» биологии ‘√Ѕќ” ¬ѕќ Ђ»ркутский государственный университетї, Ќ»ѕ„» —ибири и ƒ¬ –оспотребнадзора и лично –енату ¬икторовичу јдельшину за предоставленные фотографии макрофитов озера Ѕайкал.

Ќеоценимую помощь при написании книги оказали ее рецензенты:

¬ладимир ¬ениаминович јлешин и јндрей јнатольевич √ончаров.

ќсобую признательность выражаем »горю ёрьевичу  остикову за помощь и поддержку научных интересов.

ќт лица всех авторов, д.б.н., зав. лаб. экологической биохимии »Ѕ¬¬ –јЌ ј.ћ. јндреева

—ѕ»—ќ  —ќ –јў≈Ќ»…

A(A), √(G), “(T), ”(U), ÷(C) Ц аденин, гуанин, тимин, урацил, цитозин —BC (Compensatory Base Change) Ц полна€ компенсаторна€ замена dH2O Ц дистиллированна€ вода F81 Ц модель ‘ельзенштейна F84 Ц модифицированна€ модель  имуры K80 hCBC (hemiCBC) Ц полукомпенсаторна€ замена HEPES Ц 4-(2-оксиэтил)-1-пиперазинэтансульфонова€ кислота HKY Ц модель ’асигавы- ишино-яно JC69 Ц модель ƒжукса- антора K80 Ц двухпараметрическа€ модель  имуры K81 Ц обобщенна€ модель  имуры MES Ц 2-(N-морфолино)этансульфонова€ кислота ML (Maximum Likelihood) Ц метод максимального правдоподоби€ MP (Maximum Parsimony) Ц метод максимальной экономии Na2Ёƒ“ј Ц динатриева€ соль Ёƒ“ј NJ (Neighbor-Joining) Ц метод присоединени€ соседей T92 Ц модель “амуры TN93 Ц модель “амуры-Ќе€ TEMED Ц N, N, N', N'- тетраметилэтилендиамин TE-буфер Ц трис-Ёƒ“ј-буфер Ѕ—ј Ц бычий сывороточный альбумин Ѕ‘— Ц бромфеноловый синий ¬Ё∆’ Ц высокоэффективна€ жидкостна€ хроматографи€ ƒћ—ќ Ц диметилсульфоксид ƒЌ  Ц дезоксирибонуклеинова€ кислота ƒЌ азы Ц дезоксирибонуклеазы дЌ“‘ Ц дезоксинуклеозидтрифосфаты ƒ—Ќ (SDS) Ц додецилсульфат натри€ кƒЌ  Ц комплементарна€ ƒЌ   ÷ Ц ксиленцианол ѕјј√ Ц полиакриламидный гель п.н. Ц пар нуклеотидов ѕ÷– Ц полимеразна€ цепна€ реакци€ рƒЌ  Ц рибосомна€ ƒЌ  –Ќ  Ц рибонуклеинова€ кислота –Ќ азы Ц рибонуклеазы “ј-буфер Ц трис-ацетатный буфер “Ѕ≈-буфер (TBE) Ц трис-боратный буфер с Ёƒ“ј “—Ѕ Ц трис-солевой буфер ÷“јЅ (CTAB) Ц цетилтриметиламмоний бромид Ёƒ“ј Ц этилендиаминтетрауксусна€ кислота

–ј«ƒ≈Ћ I. ¬џƒ≈Ћ≈Ќ»≈ »  ”Ћ№“»¬»–ќ¬јЌ»≈ «≈Ћ≈Ќџ’

¬ќƒќ–ќ—Ћ≈…

√лава 1. ћетоды сбора и выделени€ зеленых водорослей из природных образцов (ј.ƒ. “емралеева, ≈.¬. ћинчева) ¬ главе собраны самые актуальные и попул€рные методы сбора зеленых водорослей из пресноводных и почвенных биотопов, в том числе и из экстремальных местообитаний. ѕодробно описаны и схематично проиллюстрированы методики получени€ накопительных смешанных культур. ѕриведены услови€ культивировани€ и фиксации альгологических проб. —формулирован р€д общих рекомендаций по методам сбора и выделени€ зеленых водорослей из природных образцов.

1.1 —бор зеленых водорослей из различных сред обитани€

¬одоросли широко распространены в любых экосистемах мира:

пресноводных, морских, почвенных и др. ¬ зависимости от местообитани€ выдел€ют следующие группы водорослей: планктонные, бентосные, аэрофильные, почвенные, литофильные, водоросли экстремальных местообитаний (гор€чих источников, снега, льда и т.д.).





»сход€ из образа жизни, выдел€ют водоросли в симбиотических ассоциаци€х (с грибами, простейшими, мхами, растени€ми и др.) и свободноживущие. ѕриемы и методы сбора различных экологических групп водорослей отличаютс€. ¬ данной главе основное внимание будет уделено описанию методик сбора водных проб фитопланктона, бентоса, перифитона, а также микроводорослей из почвенных и аэрофильных субстратов.

1.1.1 —бор планктонных и бентосных водорослей ѕод фитопланктоном обычно понимают совокупность свободноплавающих в толще воды мелких, преимущественно микроскопических водорослей (—адчиков, 2003). ¬ыбор метода пробоотбора фитопланктона зависит от типа водоема, степени развити€ водорослей и их размеров, задач исследовани€, доступности оборудовани€ и т.д. — целью изучени€ видового состава фитопланктона часто используют методы пр€мого микроскопировани€. ѕри интенсивном размножении водорослей пробы не нуждаютс€ в предварительном концентрировании. Ќаиболее надежным методом отбора проб фитопланктона считаетс€ батометрический метод, который позвол€ет учитывать водоросли всех размерных групп, правда, веро€тность вы€влени€ наиболее редких видов при просмотре под микроскопом ограниченного числа особей значительно меньше, чем при микроскопировании проб, отобранных планктонной сетью ( оровин, 2007). Ўирокое применение в практике получил батометр системы –утнера (рис. 1.1, а). ќсновна€ его часть Ц цилиндр, изготовленный из металла или плексигласа, емкостью 1-5 л. ѕрибор снабжен верхней и нижней крышками, плотно закрывающими цилиндр. ѕод воду батометр опускают с открытыми крышками, при достижении требуемой глубины в результате сильного встр€хивани€ веревки крышки закрывают отверсти€ цилиндра, который в закрытом виде извлекают на поверхность.

«аключенную в цилиндре воду через боковой патрубок, снабженный краном, сливают в приготовленный сосуд. ѕри изучении фитопланктона поверхностных слоев воды пробы отбирают, зачерпыва€ воду в сосуд определенного объема. ƒл€ работы на пресных водоемах чаще всего используют 1-2 литровые батометры, а в мор€х Ц 2 и 5 литровые (—адчиков, 2003). ¬ водоемах с незначительным развитием водорослей желательно отбирать пробы объемом не менее 1 л параллельно с сетевыми сборами, позвол€ющими улавливать малочисленные, сравнительно крупные объекты. ¬ водоемах с интенсивным развитием фитопланктона объем пробы можно уменьшить до 0.5 и даже до 0.25 л (¬ассер и др., 1989).

ƒл€ обнаружени€ малочисленных видов планктонных водорослей провод€т качественный лов планктона. ƒл€ этих целей используют метод предварительного концентрировани€ фитопланктона путем фильтрации через планктонные сети различной конструкции. Ќаиболее просты и удобны в изготовлении планктонные сети конической формы (рис. 1.1, б).

ƒл€ их изготовлени€ лучше использовать самое мелкое (не ниже є70) мельничное сито из шелковой или капроновой нити.  ачественна€ планктонна€ сеть представл€ет собой конический мешок из газа, который с помощью полосок прочной ткани сверху пришит к металлическому кольцу, а снизу Ц к стаканчику. —таканчик может открыватьс€, что позвол€ет слить собранную сетью пробу вместе с порцией воды в посуду, в которой она затем фиксируетс€ или доставл€етс€ в живом виде в лабораторию.

ѕри сборе планктона поверхностных слоев воды планктонную сеть опускают в воду так, чтобы верхнее отверстие сети находилось на рассто€нии 5-10 см над ее поверхностью. Ћитровой кружкой черпают воду из поверхностного сло€ (до 15-20 см глубины) и выливают ее в сеть, отфильтровыва€ таким образом 50-100 л воды. Ќа крупных водоемах планктонные пробы отбирают с лодки. ѕри этом необходимо т€нуть планктонную сеть на тонкой веревке за движущейс€ лодкой в течение 5мин. Ќа небольших водоемах планктонные пробы можно собирать с берега, постепенно заход€ в воду, осторожно черпа€ воду кружкой впереди себ€ и фильтру€ ее через сеть или забрасыва€ сеть на тонкой веревке в воду и осторожно выт€гива€ ее. «акончив сбор, планктонную сеть прополаскивают, чтобы отмыть водоросли, задержавшиес€ на внутренней поверхности. —концентрированную таким образом пробу планктона, наход€щуюс€ в стаканчике планктонной сети, сливают через выводную трубку в заранее приготовленную емкость (¬ассер и др., 1989).

„тобы избежать повреждений сети, ее нельз€ класть ни на какие шершавые поверхности. ’ранить сеть нужно в специально отведенном месте, лучше всего Ц в подвешенном состо€нии (если груз не открепл€етс€, он должен лежать на полу).

—гущение количественных проб фитопланктона можно осуществл€ть двум€ методами: осадочным и фильтрационным. —гущение проб осадочным методом провод€т после их предварительной фиксации и отстаивани€ в темном месте в течение 15-20 дней путем отсасывани€ среднего сло€ воды с помощью стекл€нной трубки, один конец которой зат€нут мельничным ситом є77 в несколько слоев, а второй соединен с резиновым шлангом. ќтсасывание провод€т очень медленно и осторожно, чтобы не допустить нарушени€ осадка и засасывани€ поверхностного сло€ пробы. —гущенную таким способом пробу взбалтывают и, замерив ее объем, перенос€т в сосуд меньшего размера.

ѕри сгущении проб фильтрационным методом используют Ђпредварительныеї, а при необходимости (если размеры планктонных организмов очень малы) бактериальные фильтры. ѕри этом пробы воды предварительно не фиксируют, и фитопланктон изучают в живом состо€нии. ƒл€ длительного хранени€ фильтр с осадком фиксируют в определенном объеме жидкости (¬ассер и др., 1989).

  фитобентосу относ€т водоросли, жизнь которых тесно св€зана с дном водоема (—адчиков, 2003). ѕодавл€ющее большинство видов бентосных водорослей чаще всего прочно прикреплены к субстрату с помощью ризоидов и имеют относительно небольшие размеры (до 10-25 см). —уществующие методы отбора фитобентоса предусматривают сбор водорослей с донных грунтов и отложений, в их толще (глубиной до 1 см) и в 2-3-сантиметровом придонном слое воды (“опачевский, ћасюк, 1984). Ќа мелководь€х (до 0.5-1 м) сбор фитобентоса осуществл€етс€ с помощью опускани€ на дно пробирки или сифона (—адчиков, 2003). Ќа глубине до 1.5-3 м сбор донных макрофитов можно проводить с помощью щипцов –убцова. Ќа м€гком грунте сбор фитобентоса можно проводить с помощью дночерпател€ ѕетерсена.

ƒл€ извлечени€ растений со дна при глубине воды не превышающей 2-3 м используютс€ вод€ные грабельки трех- и шестизубовые (рис. 1.3, в). –абота с грабельками с лодки производитс€ или при неподвижном ее состо€нии, или на очень тихом ходу. ”добнее работать с кормы лодки (јбакумов, 1983). ƒл€ добывани€ донной растительности с глубин, превышающих 2-3 метра, примен€ютс€ инструменты, прив€зывающиес€ к длинной веревке, с помощью которой их можно волочить по дну.

ƒлина веревки при этом должна в несколько раз превышать глубину, на которой производитс€ работа (не менее 5-6 раз):

- €корьки-кошки Ц это небольшого размера €корьки (10-15 см в высоту вместе с петлей) с различным числом зубцов (3-10). «убцы у них могут быть разной длины. ƒлинные зубцы должны чередоватьс€ с короткими. ƒл€ лучшего удержани€ водорослей на €корьке можно намотать на зубцы проволоку или веревку (рис. 1.3, г).

- двусторонние вод€ные грабли состо€т из железной планки длиной 30-35 см, толщиной 1-1.5 см с петл€ми на концах дл€ прив€зывани€ веревки (рис. 1.3, д). ћожно использовать обыкновенные железные грабли (лучше с витыми зубцами), св€зав по двое со стороны планок.

ƒл€ добывани€ водорослей со дна на больших глубинах можно также воспользоватьс€ мотком колючей проволоки с грузом, который волочат по дну на веревке, а также драгами различных конструкций:

- драга –аменского имеет овальной формы раму с мешком (рис. 1.3, е). –ама изготавливаетс€ из железной полосы шириной 5-7 см.

- четырехугольна€ драга с зубцами имеет пр€моугольную раму, сделанную из полосы железа шириной 2-3 см и толщиной около 1-1.5 см (рис. 1.3, ж) (јбакумов, 1983).

–ис. 1.1. »нструменты дл€ сбора планктонных и бентосных водорослей.

ѕримечание. а Ц батометр –утнера, б Ц планктонна€ сеть јпштейна, в Ц вод€ные грабельки, г Ц €корьки-кошки, д Ц вод€ные грабли, е Ц драга –аменского, ж Ц четырехугольна€ драга с зубцами.

ѕробы бентосных водорослей могут быть собраны также с помощью водолазных погружений. Ќа рис. 1.2 представлено фото эндемичной зеленой водоросли рода Draparnaldioides, выполненное во врем€ водолазного погружени€ на дно оз. Ѕайкал.

Ц  Ц  Ц

ѕробы бентосных водорослей вместе с субстратом, собранные в результате водолазного погружени€, перекладывают в тазы с водой на борту экспедиционного судна. ќтобранные с помощью описанных инструментов и методов пробы фитобентоса промывают через капроновое сито, водоросли аккуратно с помощью ножа отдел€ют от камней. ѕробы фитопланктона концентрируют, а затем перенос€т в емкости дл€ хранени€. —обранный материал лучше изучать в живом состо€нии и только при необходимости фиксировать 4% формалином.

ƒл€ дальнейшего молекул€рно-генетического анализа пробы водорослей заливают 80% этанолом (пробы необходимо перефиксировать минимум еще один раз). ƒл€ сохранени€ зеленой окраски водорослей в пробу можно добавить раствор медного купороса до по€влени€ голубой окраски фиксирующей жидкости (ћалый практикум, 1976). ≈сли водоросли покрыты слоем слизи, необходимо, чтобы объем фиксирующего раствора был в 2 раза больше объема водорослей (»жболдина, 2007). √ерметично закрытые фиксированные пробы хран€т в темном месте. ∆ивой материал используют дл€ микроскопировани€ или дальнейшего культивировани€.

 ажда€ проба снабжаетс€ этикеткой, на которой указывают номер пробы, дату и место отбора, орудие лова, фамилию сборщика. Ёти же данные параллельно записывают в полевом дневнике.

1.1.2 —бор почвенных и аэрофильных зеленых водорослей ѕочвенные водоросли представл€ют собой совокупность наземных, водно-наземных и собственно почвенных водорослей (Ўтина, √оллербах, 1976), в то врем€ как дл€ аэрофильных водорослей основной жизненной средой €вл€етс€ поверхность внепочвенных твердых субстратов: скалы, камни, кора деревьев, стены домов и т.д. (¬одоросли, 1989). ѕрактически с момента выхода в свет классического труда ћ.ћ. √оллербаха и Ё.ј.

Ўтиной Ђѕочвенные водорослиї (1969) на прот€жении п€ти дес€тилетий в абсолютном большинстве публикаций почвенных альгологов фраза:

Ђ—бор и обработку материала проводили по общеприн€тым в почвенной альгологии методамї без дальнейшей детализации этих методов, стала клише. ќднако, по справедливому замечанию ».ё.  остiкова с соавт.

(2001) Ђћ.ћ. √оллербах и Ё.ј. Ўтина в этом труде не предложили Ђобщеприн€тых методовї, а сделали обзор различных вариантов методик сбора и обработки почвенно-альгологических пробї. “ем не менее, следует отметить, что в практике почвенно-альгологических исследований существуют некоторые общие принципы и приемы. “ак, в случае массовых видимых разрастаний зеленых водорослей на поверхности почвы или аэрофильных субстратах в форме п€тен Ђцветени€ї, налетов, корочек и т.д. они доступны дл€ непосредственного сбора в стерильные контейнеры, пробирки или пакеты. ќднако чаще производитс€ отбор почвы или аэрофильного субстрата стерильным ножом, лопаткой или пробоотборником. »нструмент стерилизуетс€ непосредственно в полевых услови€х: протираетс€ 96% спиртом и обжигаетс€ в пламени спиртовки либо многократно втыкаетс€ в исследуемую почву. ќтобранные пробы используютс€ дл€ получени€ смешанных накопительных культур в течение 1-2 суток с момента отбора. ƒл€ длительного хранени€ образцы почв или аэрофильных субстратов высушивают в стерильных услови€х до воздушно-сухого состо€ни€ и сохран€ют дл€ дальнейшей обработки до 6 мес€цев ( остiков та iн., 2001).  роме того, исследователь может осуществл€ть отбор индивидуальных проб или смешанных образцов. »ндивидуальную пробу отбирают, как правило, при наличии на почве локальных макроскопических разрастаний зеленых водорослей. ќна охватывает небольшую глубину (преимущественно лишь 1-2 мм) и имеет незначительную площадь (до 10 см2). »ндивидуальный сбор позвол€ет вы€вить только виды, способные к Ђцветениюї почвы. —мешанную почвенную пробу отбирают, как правило, при проведении флористических и эколого-ценотических исследований. ќтбор провод€т в пределах одного фитоценоза с пробного участка, размер которого колеблетс€ от 5-30 м2 в трав€нистых фитоценозах, до 100-2500 м2 в лесных фитоценозах ( остiков та iн., 2001). —мешанна€ проба состоит из 5-50 индивидуальных проб, площадь каждой из которых составл€ет от 1 до 25 см2, при этом обща€ площадь всех индивидуальных проб, составл€ющих смешанную пробу, в работах разных исследователей колеблетс€ в пределах 10-400 см2. ѕо данным ».ё.  остiкова с соавт.

(2001) смешанные пробы, состо€щие не менее чем из п€ти индивидуальных и имеющие суммарную площадь большую чем 30-40 см2, пригодны дл€ сравнений, если точки отбора индивидуальных проб выбирались случайно. ≈сли индивидуальные пробы отбирались не случайно (например, или только в фитогенном поле определенных растений, или на участках без подстилки, или в межкроновых пространствах и т.д.), то смешанна€ проба приобретает черты индивидуальной, что уменьшает возможности ее использовани€ в сравнительно-флористическом анализе. Ќеобходимо подчеркнуть, что вследствие большого количества вариантов отбора образцов почв и аэрофильных субстратов, необходимо подробно описывать процедуру сбора.

1.1.3 —бор водорослей из экстремальных местообитаний —бор водорослей из экстремальных местообитаний (гор€чих источников, снега, льда, пещер и др.) осуществл€етс€ вместе с субстратом стерильными инструментами (ножом, совком, черпаком и др.) в одноразовые подписанные пакеты, контейнеры или пробирки. ƒо культивировани€ водорослей желательно соблюдать услови€ хранени€ проб максимально близкие к естественным по температуре и освещенности.

1.2 ѕолучение накопительных смешанных культур ѕервым этапом обработки любого субстрата, содержащего зеленые водоросли, €вл€етс€ получение накопительных смешанных культур. Ётот этап объедин€ет приемы стимул€ции роста и размножени€ водорослей следующими наиболее распространенными методами: чашечные культуры со Ђстеклами обрастани€ї, водно-почвенные культуры и культуры на жидких и твердых питательных средах. Ќеобходимо отметить, что смешанные культуры малопригодны дл€ таксономической идентификации большинства почвенных зеленых водорослей монадной, коккоидной, сарциноидной и гетеротрихальной организации, т.к.

существует высокий риск неправильного определени€ отдельных стадий развити€ одного и того же вида водоросли как нескольких самосто€тельных видов. Ќапример, представители рода Muriella отличаютс€ от рода Bracteacoccus отсутствием подвижных репродуктивных стадий. ќднако вегетативные клетки обоих родов в смешанных культурах разделить практически невозможно.

ќтличительной особенностью рода Lobosphaeropsis €вл€етс€ продолжительный период клеточного делени€. Ќедел€щиес€ клетки данной водоросли напоминают вегетативные клетки водорослей рода Chlorella, а дел€щиес€, содержащие несколько хлоропластов и пиреноидов, Ц водоросли рода Planktosphaerella. ¬ свою очередь представители рода Planktosphaerella сходны с видами рода Planktosphaeria, от которого отличаетс€ только отсутствием подвижных репродуктивных клеток. ≈ще одним примером может служить близка€ морфологическа€ характеристика видов родов Auxenochlorella и Mychonastes, различие между которыми заключаетс€ в фототрофном росте, способности синтезировать вторичные каротиноиды и отсутствии потребности в тиамине и аммонийном азоте у Mychonastes. —огласно  остiкову с соавт. (2001) точность определени€ водорослей из смешанных почвенных культур на родовом уровне составл€ет 80-90%, тогда как на видовом Ц лишь 20-40%. —ледовательно, получение смешанных культур €вл€етс€ только первым шагом в культивировании водорослей, за которым об€зательно идет очистка культур и доведение их до альгологически чистых штаммов с последующей таксономической диагностикой.

1.2.1 „ашечные культуры со Ђстеклами обрастани€ї

ћетод почвенных или чашечных культур и различные его модификации (Bristol, 1920; Lund, 1945, 1947;  остiков та iн., 2001;

√оллербах, Ўтина, 1969;  уз€хметов, ƒубовик, 2001) €вл€етс€ наиболее распространенным методом в почвенно-альгологической практике благодар€ своей простоте и максимальной близости к естественным услови€м среды (рис. 1.3, а).

ƒл€ приготовлени€ чашечной культуры необходимо:

1) поместить в чашку ѕетри 20-40 г хорошо перемешанной свежеотобранной или воздушно-сухой пробы почвы,

2) увлажнить стерильной дистиллированной водой (dH2O) или жидкой питательной средой до 60-80% от полной влагоемкости,

3) на поверхность увлажненной почвы поместить 3-5 покровных стекол, осторожно прижима€ их почве дл€ образовани€ так называемых влажных камер. ѕлощадь влажных камер должна составл€ть 40-60% от площади стекла. ¬ этих полост€х благодар€ повышенной влажности и аэрации обычно наблюдаетс€ ускоренное развитие водорослей.

4) инкубировать чашку ѕетри в культуральном боксе при стандартных услови€х.

”слови€ культивировани€, при которых водоросли выращивают при температуре 20±3C, периодическом освещении с интенсивностью 1800Ћк (54-90 моль Ј м-2 Ј с-1 дл€ люминесцентных ламп типа FLUORA или PLANT; 25-42 моль Ј м-2 Ј с-1 дл€ белых люминесцентных ламп) и 12ти или 16-ти часовом световом дне, в почвенной альгологии называют стандартными (Bold, 1970; Deason, 1976). „ерез несколько суток и далее с периодичностью раз в несколько дней стекла просматриваютс€ под микроскопом. ¬лажность почвы в чашке поддерживаетс€ периодическим добавлением стерильной воды. ¬се инструменты, покровные и предметные стекла, стекл€нна€ культуральна€ посуда предварительно стерилизуютс€. ¬есь процесс обработки чашечной культуры длитс€ 1-3 мес€ца и более.

1.2.2 ¬одные и водно-почвенные культуры ќсобенностью водных культур (рис. 1.3, б) €вл€етс€ высокое соотношение жидкой фазы к твердому субстрату Ц почве ( остiков та iн., 2001). ƒл€ приготовлени€ водной культуры необходимо:

1) поместить 1-2 г свежеотобранной или воздушно-сухой почвы в колбу на 250 мл и залить 100 мл стерильной dH2O,

2) колбу закрыть ватной пробкой и инкубировать в культуральном боксе при стандартных услови€х.

ѕри по€влении визуально заметных зеленых обрастаний и пленок, их отбирают, соскаблива€ микробиологической петлей, и готов€т препараты дл€ микроскопировани€. ¬се инструменты, предметные и покровные стекла, стекл€нна€ культуральна€ посуда предварительно стерилизуютс€. ¬есь процесс обработки культуры длитс€ 1-3 мес€ца и более.

Ќесомненным достоинством данного способа €вл€етс€ низкое содержание органического вещества, что предотвращает сильное развитие почвенных гетеротрофов (грибов, бактерий и простейших).

ќднако к недостаткам можно отнести преобладание гидрофильных и олиготрофных видов водорослей, растущих на бедных питательными веществами субстратах, и недоразвитие истинно почвенной альгофлоры.

ѕоэтому бльшую попул€рность имеет метод водно-почвенных культур (рис. 1.3, в), при приготовлении которых одна часть почвы заливаетс€ трем€ част€ми воды или питательной среды ( остiков та iн., 2001).

ƒл€ приготовлени€ водно-почвенной культуры необходимо:

1) внести в пластиковые культуральные пробирки 1 г свежей или воздушно-сухой почвы и 3 мл стерильной dH2O,

2) закрыть пробирки вентилируемыми крышками и инкубировать в культуральном боксе при стандартных услови€х.

ѕри по€влении визуально заметных зеленых обрастаний и пленок, их отбирают, соскаблива€ микробиологической петлей, и готов€т препараты дл€ микроскопировани€. ¬се необходимые инструменты и посуда предварительно стерилизуютс€. ¬есь процесс обработки культуры длитс€ 1-3 мес€ца и более. ∆идка€ фаза водно-почвенной культуры в отличие от водной культуры содержит большое количество клеток водорослей и €вл€етс€ достаточно концентрированной в отношении растворенного органического вещества, макро- и микроэлементов.

ѕоэтому с одной стороны она более близка к почвенному раствору по химическому составу, что позвол€ет выделить различные группы зеленых водорослей. — другой стороны нар€ду с водоросл€ми в этом насыщенном растворе быстро развиваютс€ почвенные гетеротрофы, от которых затем необходимо избавл€тьс€ дл€ получени€ альгологически чистой культуры.

1.2.3 ∆идкие и агаризованные культуры ћетод жидких культур (рис. 1.3, б) заключаетс€ в помещении почвенного образца в жидкую питательную среду, выбор которой осуществл€етс€ в соответствии с экофизиологическими потребност€ми исследуемой группы водорослей. ƒл€ выделени€ максимального разнообрази€ зеленых водорослей используют широкий спектр сред и добавок (см. ѕрил. 1).

–ис. 1.3. Ќакопительные смешанные культуры зеленых водорослей.

ѕримечание. а Ц чашечные культуры со Ђстеклами обрастани€ї, б Ц водные культуры и культуры на основе жидких питательных сред, в Ц водно-почвенна€ культура, г Ц культуры на агаризованной питательной среде, д Ц накопительна€ культура по методу ј. Ћукешевой.

ƒл€ приготовлени€ жидкой культуры необходимо:

1) поместить 1-2 г свежеотобранной или воздушно-сухой почвы в колбу на 250 мл и залить 100 мл питательной среды. „аще всего используютс€ среды Bristol или Bold 1N или 3N (см. ѕрил. 1).

2) закрыть колбу ватной пробкой и инкубировать в культуральном боксе при стандартных услови€х.

ѕри по€влении визуально заметных зеленых обрастаний и пленок, их отбирают, соскаблива€ микробиологической петлей, и готов€т препараты дл€ микроскопировани€. ¬се инструменты, покровные и предметные стекла, стекл€нна€ культуральна€ посуда предварительно стерилизуютс€. ¬есь процесс обработки культуры длитс€ 1-3 мес€ца и более.

ƒругой метод Ц получение накопительных культур на агаризованных питательных средах заключаетс€ в посеве небольшого количества свежеотобранной или воздушно-сухой пробы почвы на твердую питательную среду (рис. 1.3, г).

1) нанести на поверхность твердой питательной среды (1-2% агар) смыв и(или) посев со стекол обрастани€, почвенную суспензию или непосредственно почву. ѕоследний вариант также известен как метод почвенных комочков, когда осуществл€етс€ высев 5-8 небольших (3-5 мм в диаметре) комочков свежеотобранной почвы на поверхность агара.

¬оздушно-сухой почвенный образец вначале увлажн€ют до пастообразного состо€ни€, а затем микробиологической петлей или шпателем выкладывают комочки на поверхность твердой питательной среды. ѕри использовании почвенной суспензии капл€ наноситс€ в середину чашки ѕетри и растираетс€ с помощью шпател€ ƒригальского по поверхности агаризованной среды.

2) перевернуть чашку ѕетри, закрыть лентой Parafilm, подписать,

3) инкубировать чашки ѕетри в культуральном боксе при стандартных услови€х.

„ешским альгологом ј. Ћукешовой (цит.: по  остiкову та iн., 2001) был предложен интересный культуральный подход, который позвол€ет выделить разные группы водорослей, раздел€€ их экологические ниши в культуральной пробирке (рис.

1.3, д):

1) добавить в культуральную пробирку с предварительно приготовленным скошенным агаром (1.5-2%) жидкую питательную среду таким образом, чтобы только половина кос€ка была погружена в жидкость,

2) внести в пробирку микробиологической петлей небольшое количество почвы из почвенной культуры, в которой уже имеютс€ макроскопические разрастани€,

3) закрыть пробирку вентилируемой крышкой и инкубировать в культуральном боксе при стандартных услови€х.

„ерез несколько дней по линии воды на агаре начинают разрастатьс€ отдельные колонии водорослей. ѕри этом за счет разнообрази€ условий почвенные виды постепенно разрастаютс€ на поверхности агара выше кра€ воды, гидрофильные и амфибиальные виды

Ц в жидкой части культуры. ѕодобна€ дифференциаци€ ниш вы€вл€ет большое видовое разнообразие зеленых водорослей почвенной пробы.

ќсновным преимуществом использовани€ агаризованных сред €вл€етс€ то, что независимо от выбора конкретных методов получени€ накопительных культур на твердой среде, из них достаточно легко можно выделить водоросли в монокультуры.

¬ заключение главы сформулируем р€д общих рекомендаций по методам сбора и выделени€ зеленых водорослей из природных образцов:

1. ќсновными об€зательными правилами при отборе образцов водорослей или субстратов €вл€ютс€ соблюдение условий стерильности, сохранение проб в услови€х максимально близких к природным и, по возможности, их быстра€ дальнейша€ обработка.

2.  раеугольным камнем в способах выделени€ наибольшего разнообрази€ водорослей из естественной среды €вл€етс€ выбор культуральной среды и условий культивировани€. Ѕольшинство питательных сред, широко используемых альгологами (BG-11, Bristol, Chu-10 и др.), были разработаны дл€ культивировани€ пресноводных водорослей и €вл€ютс€, по сути, аналогами речных и озерных вод.

ѕоэтому их с осторожностью следует использовать при культивировании почвенных и аэрофильных водорослей. ¬ идеальном случае питательна€ среда дл€ культивировани€ почвенных водорослей должна быть приближена к жидкой фазе исследуемой почвы Ц почвенному раствору, из которого и происходит питание почвенных водорослей. ќднако, вследствие высокой динамичности и микрозональности жидкой фазы почвы в отношении содержани€ органических веществ, макро- и микроэлементов нецелесообразно полностью воспроизводить химический состав почвенного раствора и использовать его в качестве культуральной среды. ƒостаточно добавл€ть в стандарные культуральные среды почвенную выт€жку (см. ѕрил. 1) и регулировать кислотно-щелочные услови€ среды.

3. ћинимизировать стресс водорослей при выделении их из естественной почвенной среды на искусственные питательные среды (Hagemann, 2002), а, следовательно, и увеличить их культивируемое разнообразие, можно при соблюдении следующей последовательности действий: отбор почвенного образца получение смешанной культуры (чашечные и водно-почвенные культуры) очистка и культивирование монокультуры на органо-минеральных (с почвенной выт€жкой) и минеральных средах.

Ћитература

1. јбакумов ¬.ј. –уководство по методам гидробиологического анализа поверхностных вод и донных отложений. Ћенинград:

√идрометеоиздат, 1983. 240 с.

2. ¬ассер —.ѕ.,  ондратьева Ќ.¬., ћасюк Ќ.ѕ. и др. ¬одоросли.

—правочник.  иев: Ќаукова ƒумка, 1989. 608 с.

3. √оллербах ћ.ћ., Ўтина Ё.ј. ѕочвенные водоросли. Ћенинград:

Ќаука, 1969. 228 с.

4. »жболдина Ћ.ј. јтлас и определитель водорослей бентоса и перифитона озера Ѕайкал (мейо- и макрофиты) с краткими очерками по их экологии. Ќовосибирск: Ќаука-÷ентр, 2007. 248 с.

5.  оровин ¬.ѕ. ќкеанологические наблюдени€ в прибрежной зоне мор€: учебное пособие. —ѕб.: »зд-во –√√ћ”, 2007. 434 с.

6.  уз€хметов √.√., ƒубовик ».≈. ћетоды изучени€ почвенных водорослей: учебное пособие. ”фа: »зд -е Ѕашкирск. ун-та, 2001. 60 с.

7. Ќ.ѕ. √орбунова, ≈.—.  люшникова, Ќ.ј.  омарницкий и др.

ћалый практикум по низшим растени€м ћ.: ¬ысша€ школа, 1976. 216 с.

8. —адчиков ј.ѕ. ћетоды изучени€ пресноводного фитопланктона:

методическое руководство. ћ.: »зд-во Ђ”ниверситет и школаї, 2003.

157 с.

9. “опачевский ј.¬., ћасюк Ќ.ѕ. ѕресноводные водоросли ”краинской ——–.  иев: ¬ища школа, 1984. 333 с.

10. Ўтина Ё.ј., √оллербах ћ.ћ. Ёкологи€ почвенных водорослей.

ћ.: Ќаука, 1976. 143 с.

11.  остiков I.ё., –оманенко ѕ.ќ., ƒемченко ≈.ћ. тa iн. ¬одоростi грунтiв ”крањни (iсторi€ та методи дослiдженн€, система, конспект флори). K.: ‘iтосоцiо-центр, 2001. 300 c.

12. Bold H.C. Some aspects of the taxonomy of soil algae // Annals of the New York Acad. Sci. 1970. V. 175. P. 601Ц616.

13. Bristol B.M. On the alga-flora of some desiccated English soils: an important factor in soil biology // Annals Bot. 1920. V. 34. Iss. 1. P. 35Ц80.

14. Deason T.R. The genera Spongiococcum and Neospongiococcum (Chlorophyceae, Chlorococcales). 3. New species, biochemical characteristics and a summary key // Phycologia. 1976. V. 15. є 2. P.197Ц214.

15. Hagemann M. Environmental stress, signalling and basic acclimation reactions / In: Cyanobacteria and nitrogen fixation in extreme environments,

2002. European Sci Found. CYANOFIX. P. 24.

16. Lund J.W.G. Observations on soil algae. 1. The ecology, size, and taxonomy of British soil diatoms // New Phycologist. 1945. V. 44. Iss. 2. P.

196Ц219.

17. Lund J.W.G. Observations on soil algae. 2. Notes on group other than diatoms // New Phycologist. 1947. V. 46. Iss. 1. P. 35Ц60.

√лава 2. ћетоды получени€ альгологически чистых и аксеничных культур водорослей (ј.

ƒ. “емралеева) √лава посв€щена описанию основных методов очистки альгологических культур от сопутствующих бактерий, грибов и простейших с помощью механических и химических приемов, а также с использованием биологических особенностей зеленых водорослей.

ѕривод€тс€ протоколы и схемы получени€ монокультур.

—формулированы основные принципы применени€ антибиотиков дл€ получени€ аксеничных штаммов зеленых водорослей.

2.1 ѕосев штрихом ƒанный метод широко используетс€ в почвенной микробиологии (—эги, 1983; «енова и др., 2002). —хема метода приведена на рис. 2.1, а.

1) набрать микробиологической петлей из смешанной культуры небольшое количество биомассы водорослей и перенести в новую чашку ѕетри на агаризованную питательную среду, провод€ по всей поверхности агаровой пластинки штрих, частый вначале и истончающийс€ в конце,

2) перевернуть чашку ѕетри, закрыть лентой Parafilm, подписать,

3) инкубировать в культуральном боксе при стандартных услови€х.

ƒальнейшие пересевы провод€тс€ от единичных колоний в конце штриха. ѕодобный способ очистки хорошо подходит дл€ получени€ альгологически чистых, но не аксеничных культур микроводорослей с коккоидной организацией таллома.

2.2 »зол€ци€ с помощью микропипетки —уть метода отображена на рис. 2.1, б и сводитс€ к изол€ции отдельной клетки или таллома водоросли в чистую культуру с помощью стекл€нной микропипетки (√айсина и др., 2008). јлгоритм действий следующий:

1) просмотреть под стереомикроскопом или бинокул€ром препарат из смешанной культуры водорослей. ѕри высоком обилии водорослей в пробе культуру необходимо развести стерильной dH2O.

2) выт€нуть пинцетом стекл€нную пипетку ѕастера в тонкий капилл€р, держа ее над пламенем горелки, кончик капилл€ра обломить,

3) захватить выбранную клетку водоросли и поместить в стерильную каплю dH2O на предметном стекле или чашке ѕетри,

4) снова просмотреть препарат под микроскопом, при наличии других организмов процедура повтор€етс€. ƒалее возможны 2 варианта:

перенос клетки в жидкую или агаризованную питательную среду.

5) закрыть пробирку вентилируемой крышкой, подписать. »ли перевернуть чашку ѕетри, закрыть лентой Parafilm, подписать.

6) инкубировать чашку ѕетри или культуральную пробирку в культуральном боксе при стандартных услови€х.

«ахват отдельной клетки осуществл€етс€ с помощью тонкого гибкого резинового шланга или микрогруши. ƒиаметр капилл€ра должен быть в 2 раза больше диаметра клетки. ѕри меньшем диаметре есть риск повредить клетку, при большем Ц отобрать из среды вместе с клеткой и загр€знителей. ѕри выделении нитчатых зеленых водорослей пипетку лучше держать вдоль нити, направл€€ ее к концу, и под углом.

–ис. 2.1. —хемы методов получени€ альгологически чистых культур.

ѕримечание. а Ц посев штрихом, б Ц изол€ци€ с помощью микропипетки, в Ц метод последовательного разведени€, г Ц использование фототаксиса.

2.3 ћетод последовательного разведени€ ћетод очистки путем многократного последовательного разведени€ смешанной культуры наиболее эффективен при комбинировании с процедурой фильтрации и последующей очистки антибиотиками. —хема метода приведена на рис. 2.1, в. ƒанный прием хорошо подходит дл€ выделени€ мелких коккоидных зеленых водорослей. —уть метода заключаетс€ в подборе диаметра пор мембранного фильтра, с помощью которого будут улавливатьс€ крупные нитчатые и коккоидные водоросли, простейшие, грибной мицелий и споры. ѕосле фильтрации провод€т серию многократных последовательных разведений отфильтрованной среды и высев инокул€та на агаризованную среду. ћы предлагаем следующий протокол работы:

1) аккуратно гомогенизировать стерильным пестиком смешанную культуру микроводорослей, полученную смывом со стекол обрастани€ или в результате водного или водно-почвенного культивировани€,

2) фильтровать под давлением полученную суспензию водорослей через стерильный нитрат-целлюлозный фильтр с необходимым размером пор (1-10 мкм),

3) отобрать 20 мкл фильтрата и ресуспендировать в 200 мкл жидкой питательной среды в культуральном планшете,

4) провести серию последовательных разведений, количество которых нужно установить опытным путем,

5) перенести 220 мкл максимально разведенной суспензии водорослей в середину чашки ѕетри с агаризованной питательной средой,

6) растереть каплю шпателем ƒригальского по поверхности агара,

7) перевернуть чашку ѕетри, закрыть лентой Parafilm, подписать,

8) инкубировать в культуральном боксе при стандартных услови€х.

ƒл€ того чтобы мелкие грибные споры проросли и не прошли через фильтр можно за несколько дней до фильтрации добавить в смешанную накопительную культуру органический субстрат (глюкозу, мальтозу).

”добнее всего дл€ данной процедуры использовать 96-луночные микропланшеты и 8-канальный дозатор.

2.4 »спользование фототаксиса ѕриводим метод получени€ монокультуры с помощью фототаксиса, предложенный ¬.ћ.јндреевой (1998). —хема метода показана на рис.

2.1, г.

1) внести в середину чашки ѕетри на агаризованную поверхность (1.6-1.8% агар) 200-300 мкл стерильной dH2O,

2) равномерно распределить каплю шпателем ƒригальского по поверхности,

3) сразу внести в центр небольшую каплю (~30 мкл) суспензии водорослей из смешанной накопительной культуры.

4) перевернуть чашку ѕетри, закрыть лентой Parafilm, подписать,

5) инкубировать чашку ѕетри в культуральном боксе при стандартных услови€х.

¬ течение первых нескольких часов, пока на поверхности агара хранитс€ вода, водоросли успевают образовать подвижные репродуктивные клетки, которые отплывают на определенное (иногда довольно значительное) рассто€ние от центра чашки. ѕосле того как вода будет полностью впитана агаром, эти клетки в течение 1-2 недель развиваютс€ в изолированные колонии. ћетодика €вл€етс€ удобной дл€ очистки зеленых водорослей, размножающихс€ с помощью зооспор.

—мешанную накопительную культуру водорослей также можно предварительно гомогенизировать стерильным пестиком до внесени€ ее на поверхность агара.

2.5 ќчистка с помощью антибиотиков јнтибиотики Ц вещества природного или полусинтетического происхождени€, подавл€ющие рост живых клеток (бактерий, грибов, простейших). “еоретически с помощью различных антибиотиков можно уничтожить все контаминанты (загр€знители) в смешанных и альгологически чистых культурах водорослей, однако на практике такого результата достичь трудно.  ак правило, применение антибиотиков позвол€ет уменьшить количество бактерий и(или) грибов до незначительного присутстви€. —огласно современной классификации антибиотиков они различаютс€ по механизму действи€, химической структуре, противомикробному спектру, происхождению и др. (≈горов, 2004).

— учетом механизма действи€ антибиотики раздел€ют на три основные группы:

- ингибиторы синтеза клеточной стенки микроорганизма (лактамы, карбапенемы, ванкомицин, беномил и др.),

- антибиотики, нарушающие молекул€рную организацию, функции клеточных мембран (нистатин, амфотерицин и др.),

- антибиотики, подавл€ющие синтез белка и нуклеиновых кислот, в частности, ингибиторы синтеза белка на уровне рибосом (аминогликозиды, тетрациклины, хлорамфеникол и др.).

ѕо характеру воздействи€ на бактериальную клетку антибиотики бывают бактериостатические (ингибирование размножени€) и бактерицидные (гибель бактерий). ѕо химической структуре выдел€ют следующие группы антибиотиков: -лактамы (пенициллины, цефалоспорины, карбопенемы и др.), аминогликозиды (гентамицин, неомицин, стрептомицин, канамицин и др.), хлорамфеникол, тетрациклины, полиены, гликопептиды и др. Ќиже приводитс€ характеристика наиболее часто используемых антибиотиков.

1. јминогликозиды Ц группа антибиотиков, общим в химическом строении которых €вл€етс€ наличие в молекуле аминосахара, соединенного гликозидной св€зью с аминоциклическим кольцом.   антибиотикам аминогликозидного р€да относ€тс€ гентамицин, стрептомицин, неомицин, канамицин и др.

√ентамицин Ц бактерицидный антибиотик широкого спектра действи€, подавл€ет развитие грамположительных и грамотрицательных бактерий, в том числе Proteus и Pseudomonas, не оказывает воздействи€ на грибы, однако про€вл€ет антивирусную активность. ѕродуцируетс€ бактери€ми рода Micromonospora.

—трептомицин Ц бактерицидный антибиотик широкого спектра действи€, активен против бактерий родов Bacillus, Bordetella, Brucella, Klebsiella, Mycobacterium, Staphylococcus при концентрации 100 мкг/мл, Enterobacter, Corynebacterium, Proteus, Streptococcus, Vibrio Ц при концентрации 10-100 мкг/мл и Bacteroides, Clostridium Ц свыше 100 мкг/мл. ќбразуетс€ актиномицетами рода Streptomyces.

Ќеомицин Ц бактерицидный антибиотик, синтезируетс€ актиномицетами рода Streptomyces. јктивен в отношении многих грамположительных и грамотрицательных бактерий, его антимикробный спектр сходен со спектром стрептомицина, однако действие отличаетс€.

“ак, неомицин малоактивен в отношении большинства видов бактерий родов Clostridium и Streptococcus, а также вирусов, грибов и простейших.

 анамицин Ц бактерицидный антибиотик, близок к стрептомицину и неомицину, но обладает меньшей токсичностью, и устойчивость к нему развиваетс€ медленнее. ѕродуцируетс€ актиномицетом Streptomyces kanamyceticus или другими родственными бактери€ми.

2. -лактамы Ц группа антибиотиков, которые объедин€ет наличие в структуре -лактамного кольца.   -лактамам относ€тс€ подгруппы пенициллинов (пенициллин, ампициллин), цефалоспоринов, карбапенемов и др.

ѕенициллин Ц бактерицидный антибиотик, оказывающий антимикробное вли€ние в отношении широкого круга грамположительных и грамотрицательных бактерий и практически неактивен в отношении мицелиальных грибов и дрожжей. —интезируетс€ грибами рода Penicillium.

јмпициллин - полусинтетический бактерицидный антибиотик, активен в отношении грамположительных и р€да грамотрицательных микроорганизмов. ћеханизм антимикробного действи€ св€зан с угнетением активности фермента транспептидазы блокадой пептидогликана, что нарушает образование мукопептида клеточной стенки микроорганизмов и, как следствие, ингибирует биосинтез клеточной стенки (Waxman, 1983).

÷ефалоспорины (цефалоридин, цефотаксим, цефокситин) Ц бактерицидные антибиотики, в основе химической структуры которых лежит 7-аминоцефалоспоранова€ кислота. Ѕлизки к пенициллинам, но отличаютс€ большей резистентностью по отношению к -лактамазам Ц ферментам, вырабатываемым микроорганизмами. ÷ефалоридин, цефокситин и цефотаксим относ€тс€ к цефалоспоринам I, II и III поколени€, соответственно. ќни характеризуютс€ высокой антимикробной активностью в отношении в основном грамположительных бактерий, а также грамотрицательных бактерий Escherichia coli, р€да штаммов Proteus, Enterobacter, и обладают умеренной активностью по отношению к стафилококкам. ѕродуцируютс€ грибами рода Cephalosporium.

»мипенем Ц бактерицидный антибиотик группы карбапенемов.

ѕро€вл€ет устойчивость к -лактамазам. ќказывает антибактериальную активность в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Ќеактивен в отношении грибов. —интезируетс€ актиномицетами рода Streptomyces.

ћеропенем Ц бактерицидный антибиотик группы карбапенемов.

ѕро€вл€ет устойчивость к -лактамазам. ќбладает широким спектром антибактериальной активности, в большей степени подавл€ет развитие грамотрицательных и в меньшей грамположительных аэробных и анаэробных бактерий. Ќеактивен в отношении грибов. —интезируетс€ актиномицетами рода Streptomyces.

3. √ликопептиды Ц класс антибиотиков, включающий циклические или полициклические нерибосомные пептиды, например ванкомицин.

¬анкомицин Ц бактерицидный антибиотик из группы трициклических гликопептидов. ћеханизм бактерицидного действи€ обусловлен ингибированием биосинтеза клеточной стенки. ѕодавл€ет развитие грамположительных микроорганизмов, включа€ виды родов Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus. Ќеактивен в отношении грамотрицательных микроорганизмов, микобактерий и грибов.

—интезируетс€ актиномицетом Amycolatopsis orientalis.

4. “етрациклины Ц группа антибиотиков, относ€щихс€ к классу поликетидов, например тетрациклин.

“етрациклин Ц бактериостатический антибиотик широкого спектра действи€, активен в отношении грамположительных микроорганизмов родов Staphylococcus, Streptococcus, Listeria, Bacillus, Clostridium;

грамотрицательных энтеробактерий родов Escherichia, Enterobacter,

Klebsiella, Vibrio.   тетрациклину устойчивы микроорганизмы:

Pseudomonas aeruginosa, Proteus, большинство штаммов Bacteroides, грибов и вирусов. ѕродуцируетс€ актиномицетом Streptomyces anrefaciens.

5. ’лорамфеникол Ц бактериостатический антибиотик широкого спектра действи€, подавл€ет развитие многих видов грамположительных и грамотрицательных бактерий, риккетсий, спирохет, хламидий.

ќбразуетс€ актиномицетом Streptomyces venezuelae.

6. ѕротивогрибковые антибиотики Ц группа антибиотиков, в основном полиенового р€да, например нистатин, амфотерицин и др.

Ќистатин Ц фунгицидный антибиотик широкого спектра действи€, высокоактивен в отношении дрожжеподобных грибов рода Candida, не про€вл€ет антибактериальной активности. —интезируетс€ актиномицетом Streptomyces noursei.

јмфотерицин Ц полиеновый макроциклический фунгицидный антибиотик, подавл€ет рост дрожжеподобных и мицелиальных грибов, а также амеб и л€мблий. Ќе действует на бактерии, риккетсии, вирусы.

ѕродуцируетс€ актиномицетом Streptomyces nodosus.

Ѕеномил Ц полусинтетический фунгицидный антибиотик, принадлежащий группе бензимидазолов. Ўироко примен€етс€ как противогрибковый препарат дл€ многих сельскохоз€йственных, декоративных и лекарственных растений. ≈го основной метаболит карбендазим подавл€ет развитие грибов, наруша€ рост и дифференциацию гифов. ќн св€зываетс€ с микротрубочками и нарушает клеточное деление и внутриклеточный транспорт. ѕоказан ингибирующий эффект карбендазима дл€ широкого спектра грибов даже при очень низких концентраци€х, но токсического воздействи€ на водоросли отмечено не было (Mahan et al., 2005).

ѕриведем подробный протокол очистки водорослей от бактериального загр€знени€ (Andersen, 2005):

1) растворить 100 мг пенициллина (натриевой или калиевой соли), 25 мг сульфата дигидрострептомицина и 25 мг сульфата гентамицина в 10 мл dH2O,

2) простерилизовать фильтрацией и хранить в поликарбонатных пробирках в замороженном виде до использовани€. ќтта€вшие растворы можно хранить в холодильнике при 4∞C в течение нескольких недель.

3) добавить 0.5 мл приготовленного раствора к 50 мл стерильной жидкой питательной среды дл€ водорослей,

4) после посева инкубировать штаммы водорослей в культуральном боксе при стандартных услови€х, через 1-2 недели провести микроскопирование.

 онечна€ концентраци€ антибиотиков (100, 25 и 25 мг/л пенициллина, стрептомицина и гентамицина, соответственно) хорошо переноситс€ большинством водорослей. Ѕолее высокие концентрации гентамицина и пенициллина также часто €вл€ютс€ нетоксичными, но стрептомицин токсичен дл€ некоторых видов водорослей. ¬ оригинальном рецепте (Guillard, 1973) вместо гентамицина был использован хлорамфеникол (25 мг/л), но он несколько более токсичен.

ѕри загр€знении альгологической культуры бактери€ми и грибами можно использовать еще одну схему очистки (Kan, Pan, 2010):

1) добавить плохо растворимый и термостойкий беномил в питательную среду до автоклавировани€ до конечной концентрации 0.04 мг/мл,

2) приготовить стоковые растворы ампициллина (100 мг/мл) и цефотаксима (50 мг/мл), стерилизовать фильтрацией и хранить при температуре -20∞C,

3) добавить аликвоты стоковых растворов ампициллина и цефотаксима в стерильную среду до конечной концентрации 0.5 и 0.1 мг/мл, соответственно,

4) тщательно перемешать питательную среду с добавками, разлить по культуральным пробиркам,

5) после посева инкубировать штаммы в культуральном боксе при стандартных услови€х, через 1-2 недели провести микроскопирование.

ќтметим, что использование стандартных протоколов очистки культур водорослей не всегда дает необходимый эффект. ¬ыбор антибиотиков, их концентрации и продолжительности воздействи€ зависит не только от типа и сложности загр€знени€ альгологической культуры, но и от индивидуальных особенностей различных таксономических групп водорослей.

¬ целом можно сформулировать общие принципы очистки культур водорослей с помощью антибиотиков:

1. ѕри наличии у водорослей хорошо развитой слизи, в которой могут развиватьс€ бактерии, первым шагом к очистке альгологической культуры должна стать процедура по ее удалению. — этой целью можно использовать очень плотную питательную среду (5% агар).

2. ѕри использовании нескольких антибиотиков дл€ очистки культуры водорослей следует помнить о возможных антагонистических или синергетических эффектах взаимодействи€ (рис. 2.2).

3. ѕри использовании антибиотиков, угнетающих синтез клеточной стенки (пенициллин, ампициллин, цефотаксим и др.), необходимо присутствие в среде небольшого количества органического вещества, которое будет стимулировать клеточное деление. Ёто вызвано тем, что антибиотики подобного действи€ уничтожают бактерии только в фазе активного роста.  оличество органического вещества должно быть 10 мг/л среды (примерно 10-4 ћ органики с молекул€рным весом 102).

4. Ќеобходимо выдерживать чашки с антибиотиками и органическим веществом в темноте, чтобы активизировать рост гетеротрофов в течение 1-2 суток. «атем тщательно отмыть культуры от культуральной среды с антибиотиком.

5. Ќе рекомендуетс€ одновременное использование ингибиторов делени€ клеточной стенки (пенициллин) и ингибиторов клеточного роста (Guillard, 2005).

–ис. 2.2. ¬заимодействие некоторых антибиотиков, используемых дл€ деконтаминации альгологических культур.

ѕримечание. —хема нарисована по данным —моль€нникова,  алитеевского (1989).

6. ѕри добавлении антибиотиков необходимо помнить, что каждый из них имеет свои оптимальные интервалы pH, в которых про€вл€етс€ его максимальна€ антимикробна€ активность (табл. 2.1).

“абл. 2.1. √раницы оптимальных значений pH дл€ эффективного действи€ некоторых антибиотиков, примен€емых дл€ очистки альгологических культур (цит. по: ≈горов, 2004) јнтибиотик pH Ќистатин 4.5-6.5 јмпициллин 5.0-6.0 ¬анкомицин 5.0-7.0 “етрациклин 6.2-6.5 Ќеомицин 7.0-8.0 √ентамицин 7.5-8.0 —трептомицин 7.5-8.0  анамицин 7.6-8.0

7. Ќаиболее эффективны при очистке альгологических штаммов приемы комбинировани€ антибиотиков и физических процедур (фильтраци€, разведение, изол€ци€ отдельных клеток с помощью микропипетки и др.).

8. ƒл€ проверки на чистоту культуры рекомендуетс€ делать посевы на стерильный 0.25%-ный м€сной бульон: при развитии бактерий бульон быстро мутнеет. ќдновременно необходимо провести пр€мое микроскопирование культуры дл€ обнаружени€ контаминантов.

ќднако использование этих правил не гарантирует успех в получении аксеничной культуры водорослей.  аждый исследователь должен дл€ себ€ определить необходимость процедур очистки штамма.

 ак правило, дл€ целей таксономической идентификации достаточно выделить из смешанных культур Ц альгологически чистые штаммы. Ёто позволит исключить Ђдвойной учетї отдельных стадий жизненного цикла зеленых водорослей как индивидуальных видов, и повысит точность определени€. Ќеаксеничные монокультуры водорослей пригодны и дл€ продолжительного хранени€ в альгологических коллекци€х, так как описаны случаи, когда аксеничные штаммы обладали пониженной жизнеспособностью и серьезными изменени€ми в морфологии клеток (Bruckner, Kroth, 2009). Ћишь дл€ некоторых биохимических и физиологических исследований или молекул€рно-генетического анализа с универсальными праймерами потребуютс€ дополнительные приемы очистки. ѕоэтому компромиссным решением в культуральной практике €вл€етс€ хранение исходного стокового материала в виде альгологически чистой культуры с минимальным присутствием контаминантов, а при необходимости Ц получение аксеничной культуры.

Ћитература

1. јндреева ¬.ћ. ѕочвенные и аэрофильные зеленые водоросли (Chlorophyta: Tetrasporales, Chlorococcales, Chlorosarcinales). —ѕб.: Ќаука, 1998. 351 с.

2. √айсина Ћ.ј., ‘азлутдинова ј.».,  абиров –.–. —овременные методы выделени€ и культивировани€ водорослей: учебное пособие. ”фа:

»зд-во Ѕ√ѕ”, 2008. 152 с.

3. ≈горов Ќ.—. ќсновы учени€ об антибиотиках: ”чебник. ћ.: »здво ћ√”, Ќаука, 2004. 528 с.

4. «енова √.ћ., —тепанов ј.Ћ., Ћихачева ј.ј. ћанучарова Ќ.ј.

ѕрактикум по биологии почв: учебное пособие. ћ.: »зд-во ћ√”, 2002.

120 с.

5. —моль€нников ј.¬.,  алитеевский ѕ.‘. Ћечитьс€ или не лечитьс€? // ’ими€ и жизнь, 1989. є 10. —. 45Ц53.

6. —эги …. ћетоды почвенной микробиологии. ћ.:  олос, 1983. 296 с.

7.  остiков I.ё., –оманенко ѕ.ќ., ƒемченко ≈.ћ. тa iн. ¬одоростi грунтiв ”крањни (iсторi€ та методи дослiдженн€, система, конспект флори). K.: ‘iтосоцiо-центр, 2001. 300 c.

8. Andersen R.A. Algal Culturing Techniques. New York, NY, U.S.A.:

Elsevier Academic Press, 2005. 578 p.

9. Bruckner C.G., Kroth P.G. Protocols for the removal of bacteria from freshwater benthic diatom cultures // J. Phycology. 2009. V. 45. Iss. 4. 981Ц 986.

10. Guillard R.R.L. Methods for microflagellates and nannoplankton. In:

Handbook of Phycological Methods: Culture Methods and Growth Measurements (Eds: Stein J.R.). Cambridge: Cambridge University Press.,

1973. P. 69Ц85.

11. Guillard R.R.L. Purification methods for microalgae. In: Algal culturing techniques (Eds: Andersen R.A.). New York, NY, U.S.A.: Elsevier Academic Press, 2005. P. 117Ц132.

12. Kan Y., Pan J. A one-shot solution of bacterial and fungal contamination in the green alga Chlamydomonas reinhardtii by using an antibiotic cocktail // J. Phycology. 2010. V. 46. Iss. 6. P. 1356Ц1358.

13. Mahan K.M., Odom O.W., Herrin D.L. Controlling fungal contamination in Chlamydomonas reinhardtii cultures // BioTechniques. 2005.

V. 39. Iss. 4. P. 457Ц8.

14. Waxman D.J. Penicillin-binding proteins and the mechanisms of action of -lactam antibiotics // Annual Review Biochemisry. 1983. V. 52. P.

825Ц869.

–ј«ƒ≈Ћ II. ћ≈“ќƒџ »ƒ≈Ќ“»‘» ј÷»» «≈Ћ≈Ќџ’

¬ќƒќ–ќ—Ћ≈…

√лава 3. “радиционный ботанический подход к описанию видового разнообрази€ водорослей vs. современной молекул€рной идентификации (ј.ƒ. “емралеева) Ќа прот€жении 19 и 20 вв. основной таксономический вес при идентификации зеленых водорослей имели морфологические и размерные характеристики. ѕо мере развити€ молекул€рной таксономии и накоплени€ новых данных об ультраструктурных и физиологобиохимических свойствах водорослей стало очевидно, что использование исключительно фенотипических признаков, в некоторых случа€х нестабильных и весьма изменчивых, недостаточно дл€ четкого установлени€ границ таксонов различного ранга.

¬ главе рассматриваетс€ современна€ концепци€ вида зеленых водорослей. ѕодробно обсуждаютс€ диакритические морфологические признаки и их роль в молекул€рной систематике водорослей. ќписаны приемы получени€ зооспор, окрашивани€ клеточных оболочек, слизи, пиреноидов, запасных питательных веществ.

3.1  онцепци€ вида зеленых водорослей  онцепци€ вида Ц это система взгл€дов на пон€тие вида в биологии.

ќдной из распространенных €вл€етс€ морфологическа€ концепци€ вида, котора€ рассматривает вид как группу морфологически идентичных или сходных организмов (Futuyma, 1998). ћногие дес€тилети€ эта концепци€ доминировала в систематике водорослей. ќднако, выбор морфологического критери€ дл€ точной видовой диагностики достаточно сложен. ћногие морфологически сходные таксоны зеленых водорослей вследствие конвергентной эволюции и упрощени€ морфологии до одноклеточных или простых нитчатых форм €вл€ютс€ полифилетичными (Lewis, McCourt, 2004). Ќапример, роды Stichococcus и Klebsormidium в традиционной классификации зеленых водорослей рассматривались как близкородственные таксоны (Ettl, Grtner, 1995). ќба рода представл€ют собой однор€дные неветв€щиес€ нити, размножающиес€ вегетативным клеточным делением или фрагментацией на 1 или 2-х клеточные сегменты. ќднако в филогенетическом плане они состо€т в дальнем родстве и относ€тс€ к разным отделам в системе водорослей, а сам пор€док Klebsormidiales в начальном понимании €вл€етс€ полифилетичным. «а последнее дес€тилетие была показана полифили€ р€да родов зеленых водорослей: Coccomyxa (Rodrguez et al., 2008), Trebouxia (kaloud, Peksa, 2010), Trentepohlia (Rindi et al., 2009), Scenedesmus (An et al., 1999; Hegewald, Wolf 2003), Chlamydomonas (Prschold et al. 2001; Prschold, Leliaert, 2007), Planophila (Friedl, OТKelly, 2002), Chlorella (Luo et al., 2010), Chlorosarcinopsis (Watanabe et al., 2006а) и др. ѕри идентификации зеленых водорослей на основе морфологии возможна недооценка истинного биологического разнообрази€, как было уже неоднократно продемонстрировано в исследовани€х криптических видов Chlorophyta (Lewis, Flechtner, 2004; Fawley et al., 2005; kaloud, Peksa, 2010). — другой стороны, фенотипическа€ пластичность может привести к резкому увеличению количества предполагаемых видов вследствие прин€ти€ различных морфоформ зеленых водорослей за самосто€тельные виды и, следовательно, к переоценке видового разнообрази€. Ќапример, видовое богатство некоторых родов зеленых водорослей €вл€етс€ удивительно большим, например род Chlamydomonas состоит из 1166, Scenedesmus Ц из 486, Chlorella Ц из 106, Chlorococcum Ц из 84, Characium Ц из 93 видов и внутривидовых таксонов, описанных преимущественно по морфологии (Guiry, Guiry, 2014). Ћ.ј. Ћевис и ¬.–. ‘лехтнер (Lewis, Flechtner, 2004), прин€в во внимание высокую фенотипическую пластичность рода Scenedesmus, предполагают, что молекул€рный анализ вы€вит на пор€док меньше видов, чем уже описано в литературе с помощью морфологических критериев. “аким образом, упор исключительно на морфологию зеленых водорослей и предположение о том, что сходна€ морфологи€ свидетельствует о близком генетическом родстве, может привести к неточност€м и даже ошибкам в систематике.

ƒруга€ распространенна€ концепци€ вида Ц биологическа€ (изол€ционна€) Ц определ€ет вид как группу свободно скрещивающихс€ организмов, которые репродуктивно изолированы от других групп (Mayr, 1942). “ак как главным критерием данной концепции €вл€етс€ репродуктивна€ изол€ци€, проблематично примен€ть ее дл€ большого числа видов зеленых водорослей с бесполым типом размножени€. ќднако о некоторых возможност€х приблизитьс€ к биологической концепции вида с помощью молекул€рного маркера ITS2 подробно изложено в главе

7. — развитием молекул€рных технологий, филогенетическа€ концепци€ вида, основанна€ на генетической однородности попул€ции, выходит на первый план. ƒл€ оценки общего богатства видов и разнообрази€ зеленых водорослей в водных и наземных экосистемах, интерпретации их экологии и биогеографии требуетс€ полифазный подход, учитывающий морфологические, ультраструктурные, биохимические, физиологические, экологические и молекул€рные данные. ѕоэтому большинство современных работ по открытию новых дл€ науки таксонов (Watanabe et al., 2006а, б; Aslam et al., 2007; Zhang et al., 2008; Nakada, Nozaki, 2009;

Nemcov et al., 2011; Neustupa et al., 2011, 2013а, б и др.) или ревизии уже описанных (Darienko et al., 2010; Fuckov, Lewis, 2012; Hegewald et al., 2013; Skaloud et al., 2013; Matsuzaki et al., 2014 и др.) основываетс€ именно на этом подходе.

3.2 ƒиакритические морфологические признаки в современной систематике водорослей —реди морфологических признаков дл€ таксономической идентификации зеленых водорослей используют следующие:

1. тип организации таллома;

2. форма вегетативных клеток;

3. количество и форма хлоропластов;

4. способность к образованию колоний и их форма;

5. строение клеточных оболочек и наличие слизистых образований;

6. наличие, количество и строение пиреноидов;

7. количество €дер;

8. тип размножени€;

9. наличие, форма и расположение стигмы;

10. расположение, количество и тип жгутиков;

11. накопление запасных питательных веществ.

–азберем соответствие таксономическим рангам перечисленных морфологических признаков у представителей 2-х классов зеленых водорослей Chlorophyceae и Trebouxiophyceae, использу€ собственные и литературные данные.

“ип организации таллома ” зеленых водорослей наиболее распространены следующие типы морфологической организации таллома (¬ассер и др., 1989):

ћонадный (жгутиковый) тип Ц отдельные клетки, имеющие посто€нную форму, способны к активному движению в водной среде при помощи жгутиков (рис. 3.1, а). ќдиночные, собирающиес€ в колонии или ценобии (колонии с неизменным определенным числом клеток).

ћонадную структуру имеют также отдельные стадии водорослей (зооспоры, гаметы).

√емимонадный (пальмеллоидный, капсальный) тип Ц клетки, подобные монадным и имеющие некоторые характерные дл€ монадного типа органеллы, но ведущие неподвижный образ жизни (рис. 3.1, б).

„асто образуют колонии, состо€щие из слизистых выделений и погруженных в эту слизь клеток.  леткам гемимонадного типа свойственно пол€рное строение, они могут вести прикрепленный образ жизни благодар€ специальным образовани€м: слизистые подушки, стебельки или подошвы. ” нейстонных водорослей есть плавательные колпачки.

 оккоидный тип Ц клетки одиночные или колониальные (ценобиальные), одетые в плотные оболочки, без жгутиков, в вегетативном состо€нии неподвижные (рис. 3.1, в).

—арциноидный тип характеризуетс€ сочетанием коккоидного габитуса со способностью к вегетативному клеточному делению, которое происходит в различных плоскост€х, в результате чего образуютс€ двух и трехмерные комплексы клеток (рис. 3.1, г).

–ис. 3.1. “ипы талломов зеленых водорослей.

ѕримечание. а Ц монадный, б Ц гемимонадный, в Ц коккоидный, г Ц сарциноидный, д Ц нитчатый, е Ц сифональный.

Ќитчатый (трихальный) тип Ц многоклеточный таллом, клетки которого дел€тс€ преимущественно в одной плоскости и образуют нити толщиной в один или несколько р€дов (рис. 3.1, д). Ќити могут быть простыми или разветвленными. „аще всего клетки нити дел€тс€ поперечными перегородками, что обеспечивает посто€нный рост нити в длину.

–азнонитчатый (гетеротрихальный) тип возник на базе нитчатого вследствие морфологической дифференциации многоклеточных участков таллома в св€зи с приспособлением к выполнению различных функций:

прикрепительной, опорной, ассимил€ционной и пр.

“каневый (паренхиматозный, пластинчатый) тип образуетс€ за счет делени€ клеток в двух или трех направлени€х, в результате чего формируютс€ объемные или пластинчатые, листовидные слоевища, дифференцированные на ткани, которые выполн€ют различные функции.

—ифональный (неклеточный) тип Ц это много€дерное слоевище, как правило, без клеточных перегородок (рис. 3.1, е). ќно может вырастать до макроскопических размеров и иметь определенную степень дифференцировки (внешнюю расчлененность). ѕерегородки по€вл€ютс€ при повреждении таллома и в процессе размножени€.

—ифонокладальный тип представл€ет собой сложное слоевище нитчатой или другой формы, состо€щее из много€дерных элементов.

ћногие системы зеленых водорослей на основе морфологической концепции вида признавали тип организации таллома признаком на уровне пор€дков (подробнее јндреева, 1998; Prschold, Leliaert, 2007). — развитием молекул€рно-филогенетического анализа с помощью различных независимых молекул€рных маркеров было неоднократно показано, что близкородственные таксоны часто имеют абсолютно различную организацию таллома. “ак водоросли некоторых видов рода Chlamydomonas с монадной организацией филогенетически более близки сарциноидным видам родов Fasciculochloris, Heterotetracystis и Hemiflagellochloris, а не монадным родам Lobochlamys, Oogamochlamys, Chloromonas (Watanabe et al., 2006б). ѕо данным Ћ.ј. Ћевис и ‘.–.

“райнор (Lewis, Trainor, 2012) минимальное генетическое различие показали зеленые водоросли родов Spongiochloris, Protosiphon и Chlorosphaeropsis, имеющие коккоидный, сифональный и сарциноидный тип организации таллома, соответственно. “аким образом, накопленный опыт в области молекул€рной систематики не позвол€ет считать данный признак надежным дл€ разграничени€ таксонов на уровне пор€дков и семейств, но хорошо раздел€ет близкородственные роды.

‘орма вегетативных клеток, способность к образованию колоний и их форма «еленые водоросли характеризуютс€ большим разнообразием формы клеток. ѕочвенные и аэрофильные водоросли преимущественно представлены шаровидными, эллипсовидными и €йцевидными клетками (рис. 3.2, а-в). –едко встречаетс€ грушевидна€ и лимоновидна€ форма, еще реже Ц веретеновидна€, цилиндрическа€, почковидна€, серповидна€ (рис. 3.2, г-и) и др.

–азлична€ форма клеток, способность образовывать колонии и их форма €вл€ютс€ надежными диакритическими признаками, раздел€ющими роды зеленых водорослей семейства Selenastraceae:

Ankistrodesmus, Kirchneriella, Monoraphidium, Nephrochlamys, Podohedriella, Quadrigula, Raphidocelis, Rhombocystis, Selenastrum и Tetranephris. ƒанные морфологические свойства хорошо согласуютс€ с молекул€рным анализом 18S рƒЌ  (Krienitz, Bock, 2012). ¬ традиционной систематике форма клетки зеленых водорослей используетс€ как диагностический признак на родовом и видовом уровн€х (јндреева, 1998).

–ис. 3.2. ‘ормы клеток зеленых водорослей.

ѕримечание. а Ц шаровидна€, б Ц эллипсовидна€, в Ц €йцевидна€, г Ц грушевидна€, д Ц лимоновидна€, е Ц веретеновидна€, ж Ц цилиндрическа€, з Ц почковидна€, и Ц серповидна€ формы.

 оличество хлоропластов и их форма ’лоропласты зеленых водорослей представл€ют собой фотосинтетические двумембранные органеллы, содержащие хлорофиллы, ксантофиллы и другие пигменты. ѕо положению в клетке бывают пристенными и центральными (јндреева, 1998). ѕри этом пристенные хлоропласты могут быть единичными или многочисленными. ќдиночный пристенный хлоропласт может быть с отверстием или без, различной формы: шаровидной (рис. 3.3, а), блюдцевидной (рис. 3.3, б), чашевидной (рис. 3.3, в), по€сковидной (рис. 3.3, г), двулопастной (рис. 3.3, д).

÷ентральный хлоропласт всегда один, может быть билатерально или радиально симметричным (звездчатым, рис. 3.3, ж), а также асимметричным.  роме того отдельно выдел€ют губчатый (рис. 3.3, з) и сетчатый хлоропласты (рис. 3.3, и), которые сочетают в себе признаки пристенного и центрального хлоропластов. √убчатый хлоропласт заполн€ет всю клетку, за исключением небольших лакун, а сетчатый хлоропласт состоит из переплетающихс€ т€жей. ћногочисленные пристенные хлоропласты могут иметь дисковидную или линзовидную (рис. 3.3, е), глыбистую, столбчатую, пирамидальную или конусовидную формы.

–ис. 3.3. ќсновные типы хлоропластов зеленых водорослей.

ѕримечание. а Ц шаровидный без отверсти€, б Ц блюдцевидный, в Ц чашевидный, г Ц по€сковидный, д Ц двулопастной, е Ц многочисленные дисковидные, ж Ц радиально симметричный или звездчатый, з Ц губчатый, и Ц сетчатый.

—ледует отметить, что увеличение числа хлоропластов в зрелых вегетативных клетках может быть св€зано с их делением.  роме того, в молодых вегетативных клетках зеленых водорослей можно наблюдать один тип хлоропласта, например, пристенный шаровидный, а в зрелых клетках Ц другой, например сетчатый или губчатый. Ќекоторые описанные типы хлоропластов зеленых водорослей проиллюстрированы на рис. 3.4.

–ис. 3.4. ‘отографии зеленых водорослей с различными типами хлоропластов.

ѕримечание. а Ц радиально симметричный хлоропласт у Borodinellopsis texensis;

б Ц чашевидный хлоропласт, отстающий от оболочки, у Heterochlorella luteoviridis;

в Ц двулопастной хлоропласт у Myrmecia sp.; г - радиально симметричный у Actinochloris terrestris; д Ц шаровидный хлоропласт с отверстием у Chlorococcum infusionum;

е Ц многочисленные хлоропласты у Bracteacoccus giganteus. Ўкала 10 мкм.

¬ современной систематике зеленых водорослей тип хлоропласта и их количество оцениваютс€ как признаки родового уровн€, форма хлоропласта, как правило, используетс€ при разграничении видов (јндреева, 1998). Ќам неизвестно ни одного рода зеленых микроводорослей, виды которого имели бы разные типы хлоропластов в зрелых вегетативных клетках. ќднако наличие одного типа хлоропласта или одинаковое их количество у двух близкородственных родов, например Chlorella и Parachlorella, не означает их таксономической невалидности (Krienitz et al., 2004).

—троение клеточных оболочек и наличие слизистых образований ” большинства зеленых водорослей клеточные оболочки сохран€ют более или менее посто€нную форму. ¬ световом микроскопе в оболочке, как правило, наблюдают два сло€ Ц внутренний (обычно целлюлозный) и наружный (пектиновый). ќболочки могут быть инкрустированы сол€ми железа или кальци€, могут быть цельными или состо€ть из нескольких фрагментов (¬ассер и др., 1989). Ќа поверхности оболочки нередко образуютс€ разнообразные структуры: выросты, шипы, щетинки, бородавки, папиллы, ребра, складки и др. ƒл€ определени€ таких структур, кроме световой или контрастной микроскопии, необходимо использовать сканирующую электронную микроскопию. “олщина оболочки у водорослей, растущих в культуре, зависит от ее возраста: при старении могут утолщатьс€. ”толщение может быть равномерным или локальным с образованием пузыревидных выростов. ќсвобождение дочерних клеток из оболочки материнской клетки происходит путем ее разрыва или ослизнени€. ” некоторых водорослей в культуре наблюдаетс€ длительное сохранение оболочек.

—лизь вокруг оболочки может окружать одиночные клетки или быть общей колониальной, слоистой или гомогенной, иметь четкий или расплывчатый контур. —лизь способствует образованию колоний, активному перемещению водоросли в пространстве, прикреплению к поверхности с помощью слизистых дисков, ножек, подушек, переживанию неблагопри€тных условий окружающей среды (переход в пальмеллевидное состо€ние) и др. ѕри определении водорослей обычно отмечают толщину слизистой оболочки и ее изменени€ при старении культуры, гомогенность или слоистость слизи, наличие отдельных выростов и утолщений, остатков спорангиев и др. Ќекоторые описанные типы слизистых образований зеленых водорослей представлены на рис.

3.5, а-и и 3.7, а, б.

ƒл€ изучени€ химической природы клеточной оболочки используют 0.01%-ный раствор рутина красного, который окрашивает целлюлозу в синий цвет; хлор-цинк-йод Ц в фиолетовый. ƒл€ вы€влени€ структуры поверхности клеточной оболочки используют 5%-ный водный раствор нигрозина и 0.1%-ный водный раствор генцианвиолета. ѕоследний краситель нар€ду с 0.1%-ным раствором метиленового синего, также используют дл€ вы€влени€ структуры слизи. ƒл€ определени€ общих очертаний слизи примен€ют 1%-ный раствор туши (¬ассер и др., 1989).

–ис. 3.5. “ипы слизистых образований зеленых водорослей.

ѕримечание. а Ц слизиста€ колони€ Chlamydocapsa mucifera, б Ц стара€ клетка Chlorococcum infusionum с толстой слоистой слизистой оболочкой, в Ц Nautococcus pyriformis со слизистым колпачком, г Ц клетка Chlamydopodium starii со слизистой ножкой, д Ц клетка Bracteacoccus giganteus с пузыревидным утолщением, е Ц слизистые т€жи Hormotila ramosissima, ж Ц колони€ Coccomyxa corbierei со слоистой слизью, з Ц Pseudococcomyxa simplex со слизистой подушечкой, и Ц остатки слизистой оболочки вокруг округлившегос€ протопласта Neochlorosarcina minuta.

¬ традиционной систематике зеленых водорослей различные типы слизистых образований использовались в качестве признаков, раздел€ющих виды и роды. Ќапример, разграничение видов Bracteacoccus minor и B. pseudominor в традиционной системе основано на отсутствии у последнего пузыревидного слизистого выроста на клеточной оболочке (јндреева, 1998). јнализ €дерного гена 18S рƒЌ  и пластидного гена rbcL подтвердили самосто€тельность этих видов (Fukov, Lewis, 2012).

≈ще одним примером может послужить разделение родов Scotiellopsis и Coelastrella на основе наличи€ пол€рных утолщений клеточной оболочки у первого рода и отсутстви€ у второго (Kalina, Punochov, 1987).

ќднако дальнейший анализ на основе данных по 18S рƒЌ  и ITS2 показал несосто€тельность этого разделени€ (Hegewald, Hanagata, 2000;

Kaufnerov, Elis, 2013). —обственные данные по изучению морфологии, ультраструктуры и филогении членов клады Watanabea (Trebouxiophyceae, Chlorophyta) свидетельствуют, что кластеризаци€ родов Heveochlorella, Kalinella, Chloroidium, Heterochlorella от группы Watanabea+Viridiella по данным 18S рƒЌ  также подтверждаетс€ наличием у последней однослойной клеточной стенки (Temraleeva et al., unpublished). ѕоэтому данный признак в исследованной кладе можно использовать в систематике надродовых таксонов, возможно семейств.

Ќаличие, количество и строение пиреноидов ѕиреноид Ц особое образование белковой природы (в основном состоит из фермента рибулезобифосфаткарбоксилазы), размером 3-12 мкм и обычно окружен крахмальными зернами (¬ассер и др., 1989). ” большинства зеленых водорослей по 1 пиреноиду, реже их 2-3 и более.

”величение числа пиреноидов в зрелых вегетативных клетках может быть св€зано с их делением. ѕоложение пиреноида в клетке определ€етс€ типом хлоропласта (јндреева, 1998). ¬ центральном хлоропласте его положение совпадает с центром хлоропласта и клетки, в пристенном Ц пиреноид расположен в его утолщенной части. ѕиреноиды чаще всего имеют шаровидную и эллипсовидную формы, реже линзовидную или неправильную.  рахмальна€ обвертка пиреноида может быть сплошной (рис. 3.6, а) или состо€ть из 2-х (рис. 3.6, б) и более скорлупок (рис. 3.6, в), а также из нескольких крупных (рис. 3.6, г) или многочисленных зерен: удлиненных и ориентированных радиально (рис. 3.6, д) или мелких и свободно расположенных (рис. 3.6, е). ѕиреноиды, лишенные крахмальной обвертки, у зеленых водорослей встречаютс€ реже.

Ќекоторые описанные типы крахмальных обверток пиреноида зеленых водорослей представлены на рис. 3.7, а-г, е.

Ѕелковое тело пиреноида окрашиваетс€ 1%-ным раствором кислого фуксина или уксусным азокармином G в красный цвет на светло-розовом фоне.

ƒл€ приготовлени€ последнего красител€ необходимо:

1) добавить к 1 мл лед€ной уксусной кислоты 55 мл dH2O и 5 г азокармина G,

2) кип€тить полученную смесь около часа, пользу€сь обратным холодильником, охладить,

3) фильтровать и хранить в сосуде из темного стекла.

¬ большинстве случаев крахмальную обкладку пиреноида хорошо заметно в световом микроскопе. ќднако дл€ более четкой ее визуализации можно использовать цитохимическую реакцию на крахмал с помощью раствора Ћюгол€.

1) растворить 2 г йодистого кали€ в 5 мл dH2O,

2) добавить 1 г металлического йода,

3) довести объем до 300 мл dH2O, перемешать.

–ис. 3.6. —троение крахмальной обвертки.

ѕримечание. а Ц сплошна€, б Ц из двух скорлупок, в Ц из четырех скорлупок, г Ц из нескольких крупных зерен, д - из многочисленных радиально ориентированных удлиненных зерен, е Ц из многочисленных мелких и свободно расположенных зерен.

—читаетс€, что наличие/отсутствие пиреноидов €вл€етс€ диагностическим признаком видового уровн€ ( онстантинова, Ѕолдина, 2000). ». Ќеуступа с коллегами (Neustupa et al., 2007) обнаружил, что штамм водоросли, описанный исходно как морфовид Klebsormidium marinum, по молекул€рным данным относитс€ к роду Stichococcus, несмотр€ на присутствие пиреноида с крахмальной обверткой, что считалось одним из диакритических признаков, раздел€ющих эти таксоны. Ётот же коллектив авторов в 2009 году описал новый род зеленых водорослей Ц Kalinella с типовым видом K. bambusicola, хлоропласт которой содержал пиреноид (Neustupa et al., 2009). Cпуст€ 4 года ими же был обнаружен новый вид данного рода Ц K. apyrenoidosa без пиреноида (Neustupa et al., 2013а). ≈ще один пример Ц традиционное разделение родов Chlamydomonas и Chloromonas на основе отсутстви€ пиреноида у последнего (Ettl, 1970, 1983). ѕервое же молекул€рное исследование этих морфологически различных таксонов показало несосто€тельность подобного разделени€ (Buchheim et al., 1997) и в насто€щее врем€ род Chloromonas включает в себ€ как виды с пиреноидами, так и без (Hoham et al., 2002; Matzuzaki et al., 2012).

–ис. 3.7. ‘отографии зеленых водорослей с различным количеством €дер, строением обвертки пиреноида и типом слизистых образований.

ѕримечание. а Ц слизиста€ колони€ Oocystella oogama, б Ц слизиста€ колони€ Palmellopsis sp., в Ц крахмальна€ обвертка пиреноида из крупных крахмальных зерен у Chlorococcum costatozygotum, г - крахмальна€ обвертка пиреноида из многочисленных мелких крахмальных зерен у Tetracystis pampae, д Ц одно€дерные клетки Myrmecia irregularis, е Ц много€дерные клетки Deasonia multinucleata. Ўкала 10 мкм.

 оличество €дер  ак правило, клетки зеленых микроводорослей содержат одно €дро (рис. 3.7, а-д), много€дерные вегетативные клетки встречаютс€ нечасто (рис. 3.7, е). ‘орма €дер, как правило, шаровидна€ или линзовидна€.

ќбъединение одно€дерных и много€дерных видов в один род, например, Deasonia (=Ascochloris) и Neospongiococcum (Deason, 1984), не оправдывалось при исследовании филогенетических взаимосв€зей по анализу нуклеотидных последовательностей генов 18S рƒЌ  и rbcL (Skaloud et al., 2013). ѕо-видимому, различное количество €дер свидетельствует о различи€х как минимум на уровне рода.  оличество и местонахождение €дер в клетках зеленых водорослей определ€ют при микроскопировании под иммерсионным объективом. ƒл€ лучшей визуализации €дер можно использовать интерференционно-контрастную микроскопию (ƒ» -микроскопию) или красители (÷аренко, 1990).

“ип размножени€ –азмножаютс€ зеленые водоросли половым и бесполым путем с помощью вегетативных и специализированных клеток. Ѕесполое размножение осуществл€етс€ с помощью специализированных клеток Ц спор. —поры зеленых водорослей бывают подвижными Ц зооспоры (рис.

3.8, а) и неподвижными Ц апланоспоры и автоспоры (рис. 3.8, б, в).

«ооспоры обладают всеми свойствами, присущими клеткам монадной организации: пол€рностью, жгутиками, сократительными вакуол€ми и стигмой (иногда может отсутствовать). «ооспоры различаютс€ по количеству в зооспорангии; форме (эллипсоидные, €йцевидные, цилиндрические, боченковидные, реповидные и др.); количеству, типу и расположению жгутиков; наличию или отсутствию клеточной оболочки (Ђжесткиеї неметаболичные и Ђголыеї метаболичные зооспоры).

Ќеметаболичные зооспоры с жесткой оболочкой обычно несут на переднем полюсе небольшое утолщение Ц папиллу, котора€ имеет разнообразную форму: плоска€, конусовидна€, колпачковидна€, седловидна€ и др. (јндреева, 1998).

»ндукцию зооспор можно вызвать следующим приемом (Neustupa et al., 2011):

1) перенести штамм водорослей из питательной среды в пробирки с 1%-водным раствором глюкозы или стерильной dH2O,

2) инкубировать в темноте и(или) при температуре 12C,

3) просматривать культуру регул€рно, с интервалом 0.5-1 час.

Ќеподвижные споры Ц апланоспоры Ц €вл€ютс€ по своей сути несосто€вшимис€ зооспорами, пропустившими подвижную стадию, иногда содержат стигму и сократительные вакуоли, образуютс€ в меньшем или том же количестве, что и зооспоры. јвтоспоры формируютс€ как неподвижные дочерние клетки в меньшем количестве и, как правило, той группой водорослей, котора€ лишена подвижных стадий (јндреева, 1998).  роме того, бесполое размножение может проходить без образовани€ специализированных клеток. ” одноклеточных зеленых водорослей родов Dunaliella и Nannochloris наблюдаетс€ деление клетки надвое (рис. 3.8, г); у колониальных (неценобиальных) Ц фрагментаци€ колонии (Botryococcus, Dictyosphaerium), у ценобиальных (Scenedesmus, Volvox) образуютс€ дочерние ценобии внутри клеток материнского ценоби€; у сарциноидных водорослей происходит распадение клеточных пакетов и комплексов, образованных путем десмосхизиса (рис. 3.8, д). ƒесмосхизис от остальных типов делени€ отличаетс€ тем, что внутренний слой материнской оболочки принимает участие в формировании оболочки дочерних клеток (јндреева, 1998).

–ис. 3.8. “ипы бесполого и полового размножени€ зеленых водорослей.

ѕримечание. а Ц зооспорангий, б Ц апланоспорангий, в Ц автоспорангий, г Ц деление клетки надвое, д Ц комплекс клеток, образованный в результате десмосхизиса, е Ц зигота с шиповатой оболочкой, ж Ц изогами€, з Ц гетерогами€, и Ц оогами€.

ѕоловой процесс представлен разнообразными формами: изогамией (сли€ние гамет одинаковых по величине, строению и подвижности), гетерогамией (сли€ние гамет, имеющих различные размеры, но одинаковую форму) и оогамией (сли€ние утратившей подвижность более крупной женской гаметы с подвижной, имеющей жгутики, мужской гаметой) (рис. 3.8, ж-и). «иготы имеют вид обычных вегетативных клеток или могут быть окружены утолщенной, иногда скульптурированной оболочкой (рис. 3.8, е).

—пособам размножени€ в насто€щее врем€ придаетс€ серьезное диагностическое значение. ќсобый вес в современной таксономии зеленых водорослей имеют тип клеточных покровов у зооспор и тонкое строение жгутикового аппарата монадных клеток (вегетативных или зооспор). Ёти характеристики хорошо согласуютс€ с молекул€рными признаками зеленых водорослей (Watanabe et al., 2006б). Ќекоторые описанные типы бесполого и полового размножени€ проиллюстрированы на рис. 3.10, а-г.

Ќаличие, форма и расположение стигмы —тигма Ц внукриклеточный органоид, отвечающий за способность зеленых водорослей к фототаксису. ‘ункционально она св€зана со жгутиковым аппаратом и расположена в хлоропласте. ќбычно окрашена в различные оттенки красного цвета и имеет линейную, палочковидную, овальную, линзовидную или точечную формы (јндреева, 1998). ¬ традиционной систематике зеленых водорослей этот признак использовалс€ как дополнительный дл€ разграничени€ близкородственных видов. ƒальнейшие молекул€рно-филогенетические исследовани€ подтвердили его состо€тельность. “ак, дл€ разделени€ видов рода Microglena были успешно использованы такие характеристики стигмы как длина, форма и положение (Demchenko et al., 2012). √руппа украинских альгологов под руководством ».ё.  остикова описала новый вид рода Chlorochytrium Ц —.hypanicus ( остиков и др., 2012). Ќовый вид отличалс€ от типового Ц C.lemnae Ц передним положением стигмы у зооспор. јнализ данных 18S рƒЌ  обоих видов не позволил надежно их разделить, однако сравнение интронов в данном гене может подтвердить обоснованность выделени€ нового вида (Temraleeva et al., unpublished).

–асположение, количество и тип жгутиков ћонадные вегетативные клетки и монадные стадии в жизненном цикле (зооспоры и гаметы) водорослей снабжены жгутиками Ц длинными и довольно толстыми выростами клеток, снаружи покрытыми плазмалеммой. »х количество, длина, морфологи€, место прикреплени€, характер движени€ разнообразны у водорослей, но посто€нны внутри родственных групп. ¬озможности оптической микроскопии в отношении жгутикового аппарата зеленых водорослей без предварительной их обработки достаточно ограничены: можно отметить расположение жгутиков (широко расставленные, как у зооспор Dictyochloropsis; близко посаженные, как у родов Chlamydomonas, Chloromonas и др.), длину, их количество, способ биени€, место прикреплени€. ∆гутики могут прикрепл€тьс€ на переднем конце клетки (апикальные) или могут быть слегка сдвинуты вбок (субапикальные). ∆гутики, одинаковые по морфологии, называют изоморфными, если они различаютс€ Ц гетероморфными. ѕодвижные клетки зеленых водорослей (Chlorophyta) обычно обладают двум€ изоконтными жгутиками (Bold, Wynne, 1985), которые не отличаютс€ между собой по длине, внешнему виду и способу биени€ (рис. 3.9, а), иногда встречаютс€ 4 и более жгутиков (рис. 3.9, г).

ќднако зооспоры коккоидных водорослей Bracteacoccus и Dictyochloris имеют анизоконтные жгутики (Starr, 1955), т.е. одинаковые по строению, но неравные по длине (рис. 3.9, б, в). “акой же тип жгутиков описан у вегетативных клеток монадных водорослей: Heterochlamydomonas (Cox, Deason, 1969) и Spermatozopsis similis (Preisig, Melkonian, 1984), у зооспор нитчатой водоросли Microspora quadrata (Lokhorst, Star 1999) и у зооспор сарциноидных водорослей: Fasciculochloris (McLean, Trainor, 1965), Heterotetracystis (Cox, Deason, 1968) и Hemiflagellochloris (Watanabe et al., 2006б).

јкронематический (бичевидный) жгутик (рис. 3.9, д), несущий нитевидный цитоплазматический вырост (акронему) на дистальном конце жгутика ( арпов, 2001), у зеленых водорослей встречаетс€ достаточно редко, например, у представителей класса Mammiellophyceae.

Ќемногочисленные представители Chlorophyta относ€тс€ к стефаноконтам, которые имеют венчик жгутиков на переднем конце клетки (рис. 3.9, е), например, водоросли пор€дка Oedogoniales (Alberghina et al., 2006). ¬се жгутики зеленых водорослей без мастигонем, но могут быть покрыты чешуйками и волосками. Ќаблюдени€ за длиной жгутиков, характером их движени€, местом прикреплени€ провод€т на живом материале с помощью световой и фазово-контрастной микроскопии.

 ак правило, морфологические различи€ жгутиков вегетативных клеток или зооспор позвол€ют раздел€ть зеленые водоросли на уровне видов и родов. ƒл€ исследований более высоких таксономических рангов (пор€дков, классов) зеленых водорослей необходимы ультраструктурные исследовани€ жгутикового аппарата с помощью электронной микроскопии.

–ис. 3.9. “ипы жгутиков у монадных форм и стадий зеленых водорослей.

ѕримечание. а Ц два изоконтных жгутика, б Ц два анизоконтных жгутика слегка неравных по длине, в Ц два анизоконтных жгутика сильно неравных по длине, г Ц четыре изоконтных жгутика, д Ц один акронематический жгутик, е Ц стефаноконтные жгутики.

Ќакопление запасных питательных веществ ¬ качестве запасных питательных веществ у зеленых водорослей обычно отмечают крахмал, липиды, изредка волютин и белковые гранулы.  рахмал откладываетс€ в строме хлоропласта в виде мелких зерен и вокруг пиреноида, образу€ его обвертку. Ћипиды накапливаютс€ в цитоплазме стареющих и поко€щихс€ клеток в форме масл€нистых мелких или крупных капель, бесцветных или окрашенных в различные цвета: желтый, оранжевый, красный, оливковый и др. ¬олютин и белковые гранулы рассе€ны в виде гранул в цитоплазме. Ќа рис. 3.10, д, е отмечены морфологические изменени€ водорослей при старении культуры. ƒл€ вы€влени€ запасных питательных веществ используют следующие красители (¬ассер и др., 1989): крахмал окрашивают йодсодержащими красител€ми, липиды Ц суданом III (0.1 г судана III в 20 мл абсолютного этилового спирта) или оксидом осми€ (IV).

Ќекоторые группы зеленых водорослей, особенно из почвенных и экстремофильный местообитаний, способны к гиперсинтезу вторичных каротиноидов, которые (в отличие от первичных или фотосинтетических каротиноидов) не участвуют в фотосинтезе, но играют важную роль в экранировании избыточной фотосинтетически активной радиации, создании стока дл€ избыточных фотоассимил€тов, а также подавлении образовани€ и детоксикаци€ уже образовавшихс€ активных форм кислорода (—оловченко, 2013).

–ис. 3.10. ‘отографии размножени€ и старени€ зеленых водорослей.

ѕримечание. а Ц диады и тетрады клеток Tetracystis aggregata, образующиес€ в результате десмосхизиса, зиготы с шиповатой оболочкой; б Ц зооспора Hemiflagellochloris kazakhstanica, в Ц апланоспоры Spongiochloris excentrica в оболочке материнского споранги€; г Ц автоспоры Pseudococcomyxa simplex; д Ц изменение окраски хлоропласта и утолщение слизистых оболочек Hemiflagellochloris kazakhstanica, е Ц капли оранжевого масла в старых клетках Spongiochloris spongiosa. Ўкала 10 мкм.

¬ целом, вторичный каротиногенез Ц это адаптивна€ реакци€ зеленых водорослей к неблагопри€тным факторам окружающей среды, заключающа€с€ в инициировании и накоплении в липидных включени€х цитоплазмы и хромопластов кетокаротиноидов группы астаксантина („елебиева, 2014). ƒанна€ способность была предложена ».ё.  остиковым в качестве признака дл€ выделени€ пор€дка Protosiphonales внутри класса Chlorophyceae ( остиков и др., 2012).

¬нутри этого же класса зеленых водорослей несколько близкородственных родов пор€дка Sphaeropleales (Muriella, Bracteacoccus и Chromochloris) синтезируют вторичные каротиноиды, окрашивающие культуры в €рко-оранжевый цвет (Fukov et al., 2012). ƒл€ недавно открытых 3-х новых родов пор€дка Sphaeropleales (Rotundella, Tumidella и Bracteamorpha) также была характерна эта особенность (Fukov et al., 2014). ќднако возможность использовани€ этого признака в качестве критери€ в систематике зеленых водорослей все еще обсуждаетс€.

Ќекоторые морфологические характеристики €вл€ютс€ приспособительными и завис€т от условий окружающей среды, а, следовательно, могут быть достаточно вариабельными. Ќапример, слизь, соедин€ющие т€жи, одиночный или колониальный образ жизни, формирование игл у видов Chlorella-клады €вл€ютс€ адаптивным ответом на факторы окружающей среды, такие как выедание, эндосимбиотическое или наземное существование (Luo et al., 2006, 2010). ѕредставителей рода зеленых водорослей Mychonastes традиционно отличали от Pseudodictyosphaerium по образу жизни: свободноживущие в первом случае и колониальные во втором. ќднако это морфологическое различие родов не подтвердилось молекул€рными данными, и оба таксона были объединены в род Mychonastes (Krienitz et al., 2011). ¬ р€де работ по Scenedesmus было убедительно показано, что такие морфологические признаки видов как присутствие и форма шипов, величина колонии завис€т от температуры окружающей среды (Trainor, 1991; Trainor, Egan 1991). “аким образом, подобные признаки не могут быть диагностически значимыми при таксономическом определении данных родов. ѕодвод€ итог, следует подчеркнуть, что при разделении таксонов водорослей всегда должен использоватьс€ целый набор диакритических морфологических признаков, который €вл€етс€ индивидуальным в зависимости от уровн€ таксономической категории и биологических особенностей исследуемой группы зеленых водорослей.

Ћитература

1. јндреева ¬.ћ. ѕочвенные и аэрофильные зеленые водоросли (Chlorophyta: Tetrasporales, Chlorococcales, Chlorosarcinales). —ѕб.: Ќаука, 1998. 351 с.

2. ¬ассер —.ѕ.,  ондратьева Ќ.¬., ћасюк Ќ.ѕ. и др. ¬одоросли.

—правочник.  иев: Ќаукова думка, 1989. 608 с.

3.  арпов —.ј. —троение клетки протистов: учебное пособие. —ѕб.:

“≈——ј, 2001. 384 с.

4.  онстантинова ».ј., Ѕолдина ќ.Ќ. —равнительный анализ ультраструктуры пиреноидов зеленых монадных и коккоидных водорослей // ‘изиологи€ растений. 2000. “. 47. є 5. —. 747Ц751.

5.  остиков ».ё., ƒемченко Ё.Ќ., Ѕойко ¬.–., √ончаров ј.ј.

Chlorochytrium hypanicus sp. nov. (Chlorophyceae) и его место в системе Protosiphonales // јльгологи€. 2012. “. 22. є 3. —. 227Ц249.

6. —оловченко ј. ≈. ‘изиологи€ и адаптивное значение вторичного каротиногенеза у зеленых микроводорослей // ‘изиологи€ растений.

2013. “. 60. є 1, —. 3-16.

7. ÷аренко ѕ.ћ.  раткий определитель хлорококковых водорослей ”краинской C—–.  иев: Ќаукова думка, 1990. 210 с.

8. „елебиева Ё.—. ќсобенности вторичного каротиногенеза у зеленых микроводорослей: ƒис. Е канд.биол.наук. - —евастополь, 2014. Ц 154 с.

9. An S.S., Friedl T., Hegewald E. Phylogenetic relationships of Scenedesmus and Scenedesmus-like coccoid green algae as inferred from ITS-2 rDNA sequence comparisons // Plant Biol. 1999. V. 1. Iss. 4. P. 418Ц428.

10. Alberghina J., Vigna M., Confalonieri V. Phylogenetic position of the Oedogoniales within the green algae (Chlorophyta) and the evolution of the absolute orientation of the flagellar apparatus // Plant. Syst. Evol. 2006. є261.

P. 151Ц163.

11. Aslam Z., Shin W., Kim M.K. et al. Marinichlorella kaistiae gen. et sp. nov. (Trebouxiophyceae, Chlorophyta) based on polyphasic taxonomy // J.

Phycology. 2007. V. 43. Iss. 3. P. 576Ц584.

12. Bold H.C., Wynne M.J. Introduction to the Algae. NJ. Prentice-Hall Inc, New Jersey: Englewood Cliffs, 1985. 2nd ed. 720 p.

13. Buchheim M.A., Buchheim J.A., Chapman R.L. Phylogeny of Chloromonas (Chlorophyceae): a study of 18S ribosomal RNA gene sequences // J. Phycology. 1997. є 33. P. 286Ц293.

14. Cox E.R., Deason T.R. Axilosphaera and Heterotetracystis, new Chlorosphaeracean genera from Tennessee soil // J. Phycology. 1968. V. 4. Iss.

3. P. 240Ц249.

15. Cox E.R., Deason T.R. Heterochlamydomonas, a new alga from Tennessee // J. Tenn. Acad. Sci. 1969.V. 44.4. є P. 105Ц107.

16. Darienko T., Gustavs L., Mudimu O. et al. Chloroidium, a common terrestrial coccoid green alga previously assigned to Chlorella (Trebouxiophyceae, Chlorophyta) // Eur. J. Phycology. 2010. V.45. Iss. 1. P.

79Ц95.

17. Deason T.R. A discussion of the classes Chlamydophyceae and Chlorophyceae and their subordinate taxa // Plant. Syst. Evol. 1984. V. 146. є 1/2. P. 75Ц86.

18. Demchenko E., Mikhailyuk T., Coleman A.W., Proschold T. Generic and species concepts in Microglena (previously the Chlamydomonas monadina group) revised using an integrative approach // European Journal of Phycology

2012. V. 47. Iss. 3. P. 264Ц290.

19. Ettl H. Die Gattung Chloromonas Gobi emend. Wille (Chlamydomonas und Die Nchstverwandten Gattungen I) In: Beihefte zur Nova Hedwigia Beihefte. 1970. H. 34. 283 p.

20. Ettl H. Chlorophyta I. Phytomonadina // Swasserflora von Mitteleuropa (Eds: Ettl H., Gerloff J., Heynig H., Mollenhauer D.). Stuttgart and New York: Gustav Fischer Verlag, 1983. V. 9. 807 p.

21. Ettl H., Grtner G. Syllabus der Boden-, Luft- und Flechtenalgen.

Stuttgart: Gustav Fischer, 1995. 721 p.

22. Fawley M.W., Fawley K.P., Owen H.A. Diversity and ecology of small coccoid green algae from Lake Itasca, Minnesota, USA, including Meyerella planktonica, gen. et sp. nov. // Phycologia. 2005. V. 44. Iss. 1. P.

35Ц48.

23. Friedl T., O'Kelly C.J. Phylogenetic relationships of green algae assigned to the genus Planophila (Chlorophyta): evidence from 18S rDNA sequence data and ultrastructure // Eur. J. Phycology. 2002. V. 37. Iss. 3 P.

373Ц384.

24. Fukov C., Lewis L.E. Intersection of Chlorella, Muriella and Bracteacoccus: Resurrecting the genus Chromochloris Kol et Chodat (Chlorophyceae, Chlorophyta) // Fottea. 2012. V. 12. є 1. P. 83Ц93.

25. Fukov K., Lewis P.O., Lewis L.A. Putting incertae sedis taxa in their place: a proposal for ten new families and three new genera in Sphaeropleales (Chlorophyceae, Chlorophyta) // J. Phycology. 2014. V. 50. Iss.

1. P. 14Ц25.

26. Futuyma D.J. Evolutionary Biology. Sunderland, Massachusetts:

Sinauer Associates. 1998. 3rd ed. 751 p.

27. Guiry M.D., Guiry G.M. AlgaeBase [Electronic resource] // National

University of Ireland, Galway. 2014 [Official website]. URL:

http://www.algaebase.org (accessed: 28.07.2014).

28. Hegewald E., Bock C., Krienitz L. A phylogenetic study on Scenedesmaceae with the description of a new species of Pectinodesmus and the new genera Verrucodesmus and Chodatodesmus (Chlorophyta, Chlorophyceae) // Fottea. 2013. V. 14. є 2. P. 149Ц164.

29. Hegewald E., Hanagata N. Phylogenetic studies on Scenedesmaceae (Chlorophyta) // Algol. Stud. 2000. є 100. P. 29Ц49.

30. Hegewald E., Wolf M. Phylogenetic relationships of Scenedesmus and Acutodesmus (Chlorophyta, Chlorophyceae) as inferred from 18S rDNA and ITS-2 sequence comparisons // Plant Syst. Evol. 2003. V. 241. Iss. 3-4.

P. 185Ц191.

31. Hoham R.W., Bonome T.A., Martin C.W., Leebens-Mack J.H. A combined 18S rDNA and rbcL phylogenetic analysis of Chloromonas and Chlamydomonas (Chlorophyceae, Volvocales) emphasizing snow and other cold-temperature habitats // J. Phycology. 2002. V. 38. Iss. 5. P. 1051Ц1064.

32. Kalina T., Punochov M. Taxonomy of the subfamily Scotiellocystoideae Fott 1976 (Clorellaceae, Chlorophyceae) // Algol. Stud.

1987. є 45. P. 473Ц521.

33. Kaufnerov V., Elis M. The demise of the genus Scotiellopsis Vinatzer (Chlorophyta) // Nova Hedwigia. 2013. B. 97. H. 3-4. P. 415Ц428.

34. Krienitz L., Bock C. Present state of the systematics of planktonic coccoid green algae of inland waters. 2012. V. 698. Iss. 1. P. 295Ц326.

35. Krienitz L., Bock C., Dadheech P.K., Prschold T. Taxonomic reassessment of the genus Mychonastes (Chlorophyceae, Chlorophyta) including the description of eight new species // Phycologia. 2011. V. 50. Iss.

1. P. 89Ц106.

36. Krienitz L., Hegewald E.H., Hepperle D. et al. Phylogenetic relationship of Chlorella and Parachlorella gen. nov. (Chlorophyta, Trebouxiophyceae) // Phycologia. 2004. V. 43. Iss. 5. P. 529Ц542.

37. Lewis L.A., Flechtner V.R. Cryptic species of Scenedesmus (Chlorophyta) from desert soil communities of western North America // J. Phycology. 2004. V. 40. Iss. 6. P. 1127Ц1137.

38. Lewis L.A., McCourt R.M. Green algae and the origin of land plants // Amer. J. Bot. 2004. V. 91. є 10. P. 1535Ц1556.

39. Lewis L.A., Trainor F.R. Survival of Protosiphon botryoides (Chlorophyceae, Chlorophyta) from a Connecticut soil dried out for 43 years // Phycologia. 2012. V. 51. є 6. P. 662Ц665.

40. Lokhorst G.M., Star W. The flagellar apparatus structure in Microspora (Chlorophyceae) confirms a close evolutionary relationship with unicellular green algae // Plant Syst. Evol. 1999. V. 217. Iss. 1-2. P. 11Ц30.

41. Luo W., Pflugmacher S., Prschold T. et al. Genotype versus phenotype variability in Chlorella and Micractinium (Chlorophyta, Trebouxiophyceae) // Protist. 2006. V. 157. Iss. 3. P. 315Ц333.

42. Luo W., Prschold T., Bock C., Krienitz L. Generic concept in Chlorella-related coccoid green algae (Chlorophyta, Trebouxiophyceae) // Plant Biol. 2010. V. 12. Iss. 3. P. 545Ц553.

43. Matzuzaki R., Hara Y., Nozaki H. A taxonomic revision of Chloromonas reticulata (Volvocales, Chlorophyceae), the type species of the genus Chloromonas, based on multigene phylogeny and comparative light and electron microscopy // Phycologia. 2012. V. 51. Iss. 1. P. 74Ц85.

44. Matsuzaki R., Hara Y., Nozaki H. A taxonomic study of snow Chloromonas species (Volvocales, Chlorophyceae) based on light and electron microscopy and molecular analysis of cultured material // Phycologia. 2014. V.

53. Iss. 3. P. 293Ц304.

45. Mayr E. Systematics and the origin of species. New York: Columbia Univ. Press, 1942. 334 p.

46. McLean R.J., Trainor F.R. Fasciculochloris, a new chlorosphaeracean alga from a Connecticut soil // Phycologia. 1965. V. 4. Iss. 3. P. 145Ц148.

47. Nakada T., Nozaki H. Taxonomic study of two new genera of fusiform green flagellates, Tabris gen. nov. and Hamakko gen. nov.

(Volvocales, Chlorophyceae) // J. Phycology. 2009. V. 45. Iss. 2. P. 482Ц492.

48. Nemcov Y., Elis M., Skaloud P. et al. Jenufa gen. nov.: a new genus of coccoid green algae (Chlorophyceae, incertae sedis) previously recorded by environmental sequencing // J. Phycology. 2011. V. 47. Iss. 4. P.

928Ц938.

49. Neustupa J., Elis M., Sejnohov L. A taxonomic study of two Stichococcus species (Trebouxiophyceae, Chlorophyta) with a starchenveloped pyrenoid // Nova Hedwigia. 2007. B. 84. H. 1-2. P. 51Ц63.

50. Neustupa J., Elis M., Skaloud P. et al. Xylochloris irregularis gen. et sp. nov. (Trebouxiophyceae, Chlorophyta), a novel subaerial coccoid green alga // Phycologia. 2011. V. 50. Iss. 1. P. 57Ц66.

51. Neustupa J., Nemcov Y., Elias M., Skaloud P. Kalinella bambusicola gen. et sp. nov. (Trebouxiophyceae, Chlorophyta), a novel coccoid Chlorella-like subaerial alga from Southeast Asia // Phycological Research. 2009. V. 57. Iss. 3. P. 159Ц169.

52. Neustupa J., Nemcov Y., Vesel J. et al. Leptochlorella corticola gen. et sp. nov. and Kalinella apyrenoidosa sp. nov.: two new Chlorella-like green microalgae (Trebouxiophyceae, Chlorophyta) from subaerial habitats // Int. J. Syst. and Evol. Microb. 2013а. V. 63. Pt 1.P. 377Ц387.

53. Neustupa J., Nemcov Y., Vesel J. et al. Parachloroidium gen. nov.

(Trebouxiophyceae, Chlorophyta), a novel genus of coccoid green algae from subaerial corticolous biofilms // Phycologia. 2013б.V. 52. є 5. P. 411Ц421.

54. Preisig H.R., Melkonian M.A light and electron microscopical study of the green flagellate Spermatozopsis similis spec. nova // Plant Syst. Evol.

1984. V. 146. Iss. 1-2. P. 57Ц74.

55. Prschold T., Leliaert F. Systematics of the green algae: Conflict of classic and modern approaches // Unravelling the Algae: the Past, Present, and Future of the Algae Systematics. London: Taylor and Francis, 2007. P. 123Ц 153.

56. Prschold T., Marin B., Schlsser U.G., Melkonian M. Molecular phylogeny and taxonomic revision of Chlamydomonas (Chlorophyta). I.

Emendation of Chlamydomonas Ehrenberg and Chloromonas Gobi, and description of Oogamochlamys gen. nov. and Lobochlamys gen. nov. // Protist.

2001. V. 152. Iss. 4. P. 265Ц300.

57. Rindi F., Lam D.W., Lopez-Bautista J.M. Phylogenetic relationships and species circumscription in Trentepohlia and Printzina (Trentepohliales, Chlorophyta) // Mol. Phyl. Evol. 2009. V. 52. Iss. 2. P. 329Ц339.

58. Rodrguez F., Feist S.W., Guillou L. et al. Phylogenetic and morphological characterisation of the green algae infesting blue mussel Mytilus edulis in the North and South Atlantic oceans // Dis. Aq. Org. 2008. V. є 81.

3. P. 231Ц240.

59. Skaloud P., Kalina T., Nemjov K. et al. Morphology and phylogenetic position of the freshwater green microalgae Chlorochytrium (Chlorophyceae) and Scotinosphaera (Scotinosphaerales, ord. nov., Ulvophyceae) // J. Phycology. 2013. V. 49. Iss. 1. P. 115Ц129.

60. Skaloud P., Peksa O. Evolutionary inferences based on ITS rDNA and actin sequences reveal extensive diversity of the common lichen alga Asterochloris (Trebouxiophyceae, Chlorophyta) // Mol. Phylogen. Evol. 2010.

V. 54. Iss. 1. P. 36Ц46.

61. Starr R.C. A comparative study of Chlorococcum meneghini and other spherical, zoospore-producing genera of the Chlorococcales.

Bloomington: Indiana University Publications. Sci. Ser., 1955. є 20. 111 p.

62. Trainor F.R. The format for a Scenedesmus monograph // Algol. Stud.

1991. є 61. P. 47Ц53.

63. Trainor F.R., Egan P.F. Discovering the various ecomorphs of Scenedesmus. The end of a taxonomic era // Arch. Protistenk. 1991. V. 139. є 1-4. P. 125Ц132.

64. Watanabe S., Mitsui K., Nakayama T., Inouye I. Phylogenetic relationships and taxonomy of sarcinoid green algae: Chlorosarcinopsis, Desmotetra, Sarcinochlamys gen. nov., Neochlorosarcina, and Chlorosphaeropsis (Chlorophyceae, Chlorophyta) // J. Phycology. 2006а. V.

42. Iss. 3. P. 679Ц695.

65. Watanabe S., Tsujimura S., Misono T. et al. Hemiflagellochloris kazakhstanica gen. et sp. nov.: a new coccoid green alga with a flagella of considerably unequal lengths from a saline irrigation land in Kazakhstan (Chlorophyceae, Chlorophyta) // J. Phycology. 2006б. V. 42. Iss. 3. P. 696Ц 706.

66. Zhang J., Huss V.A.R., Sun X. et al. Morphology and phylogenetic position of a trebouxiophycean green alga (Chlorophyta) growing on the rubber tree, Hevea brasiliensis, with the description of a new genus and species // Eur.

J. Phycology. 2008. V. 43. Iss. 2. P. 185Ц193.

√лава 4. ќсновы молекул€рной идентификации (ћинчева ≈.

¬., ј.ƒ. “емралеева) ¬ главе описаны основы ƒЌ -штрихкодировани€ зеленых водорослей, возникающие перед исследователем проблемы при использовании этой технологии и пути решени€. ќбсуждаетс€ важность выбора молекул€рного маркера и характеристики наиболее попул€рных из них. ѕриведена концептуальна€ схема молекул€рной идентификации и филогенетического анализа, указаны принципиальные различи€ между ними.

–ассмотрены принципы работы с генетическими базами данных:

GenBank, BOLDSYSTEMS и ITS2 DataBase.

4.1 ћетоды молекул€рной идентификации: преимущества и недостатки, проблемы и пути решени€  онцепци€ вида, пожалуй, наиболее обсуждаемый предмет эволюционной биологии, о чем свидетельствует существование более двадцати определений вида, основанных на различных подходах, методах и критери€х (Hey, 2001). ѕодробно современна€ концепци€ вида зеленых водорослей изложена в главе 3.1. “рудности в определении и уточнении таксономического статуса организмов могут быть решены с помощью привлечени€ различных молекул€рных методов идентификации, основанных на анализе последовательностей ƒЌ  и белков. Ёти методы имеют теоретическое обоснование в рамках теории нейтральной эволюции, согласно которой большинство из замен в ƒЌ  и белках эффективно нейтральны, и по этой причине неизбежно и по определенными законам накапливаютс€ при расхождении видов (Kimura, 1968; King, Jukes, 1969). ¬ результате этого представители одного вида несут определенную последовательность ƒЌ  (или белка), отличную от представителей других видов. “еоретические предсказани€ закономерностей молекул€рной эволюции достаточно хорошо согласуютс€ с наблюдени€ми на реальных биологических объектах.

ѕопул€рным подходом к видовой идентификации организмов €вл€етс€ технологи€ ƒЌ -штрихкодировани€, предложенна€ в 2003 г. канадским ученым ѕолом ’ебертом. —уть данного подхода состоит в молекул€рной идентификации разнообрази€ всего живого мира на основе расшифровки одного и того же участка генома, последовательность которого будет одинаковой у особей одного вида, но отличатьс€ у разных видов.

“акой участок называетс€ ƒЌ -штрихкод (DNA-barcode) и должен удовлетвор€ть следующим требовани€м (Ўнеер, 2009):

1.  оротка€ длина Ц не более 700-800 п.н. дл€ облегчени€ выделени€, амплификации и секвенировани€ ƒЌ .

2.  онсервативность, чтобы штрихкоды можно было амплифицировать с широкоспецифичными праймерами.

3. Ћегкое выравнивание, т.е. штрихкод должен содержать мало инделей (вставок-удалений).

“аким образом, ген, участок которого мог бы стать потенциальным ƒЌ -штрихкодом, должен быть хорошо изучен. ¬ насто€щее врем€ молекул€рные данные о зеленых водоросл€х быстро накапливаютс€. “ак, например, секвенированы полные геномы 10 зеленых водорослей (€дерные, пластидные или митохондриальные): Ostreococcus tauri (Derelle et al., 2006), O. lucimarinus (Palenik et al., 2007) и Micromonas pusilla и M.

sp. (Worden et al., 2009), Chlamydomonas reinhardtii (Merchant et al., 2007), Volvox carteri (Prochnik et al., 2010), Chlorella variabilis (Blanc et al., 2010), Auxenochlorella protothecoides (Gao et al., 2014), Coccomyxa subellipsoidea (Blanc et al., 2012), Helicosporidium sp. (de Koning, Keeling, 2006; Pombert, Keeling, 2010). ѕродолжаютс€ несколько геномных проектов, результатами которых должна стать полна€ расшифровка геномов зеленых водорослей родов Coccomyxa, Dunaliella, Bathycoccus, Botryococcus и дополнительных штаммов Ostreococcus и Micromonas (Tirichine, Bowler, 2011). Ѕыстро развивающиес€ методы технологии высокопроизводительного секвенировани€ (Next-Generation Sequencing, NGS) позвол€ют массово открывать и изучать свойства генов, тем самым расшир€€ список потенциальных ƒЌ -штрихкодов дл€ надежной таксономической идентификации организмов.

ƒл€ таксономической идентификации зеленых водорослей с помощью технологии ƒЌ -штрихкодировани€ необходимо выделить ƒЌ  исследуемого объекта из культуры или природного образца, амплифицировать участок гена (ƒЌ -штрихкод) с помощью подобранных праймеров и расшифровать его последовательность (рис.

4.1). ƒалее полученную последовательность нужно сравнить с референсным образцом из базы данных. » согласно прин€тому уровню генетических различий сделать вывод о принадлежности организма к конкретному таксону. —ледует отметить, что ƒЌ -штрихкодирование все еще остаетс€ технологией будущего, т.к. до сих пор не прин€т официальный ƒЌ -штрихкод зеленых водорослей, не установлены пороговые величины генетических различий. ¬озможно, именно потому, что филогенетика еще не исчерпала себ€ как наука и продолжает бурно развиватьс€ (јлешин, 2013). » в насто€щее врем€ дл€ идентификации водорослей до необходимой таксономической категории большинство исследователей используют молекул€рно-филогенетический анализ, основна€ задача которого заключаетс€ в установлении родственных св€зей между живыми организмами на основе изучени€ структуры макромолекул (ƒЌ , белков), хот€ и включает их идентификацию.

–ис. 4.1. ќбща€ схема видовой идентификации зеленых водорослей с помощью ƒЌ -штрихкодировани€.

ћолекул€рно-филогенетический анализ можно разделить на 2 блока: молекул€рный (работа с ƒЌ ) и филогенетический анализ (работа с расшифрованной нуклеотидной последовательностью). ћолекул€рный анализ включают следующие процедуры: экстракци€ или выделение суммарной ƒЌ , амплификаци€ необходимого фрагмента ƒЌ  с помощью подобранных праймеров, электрофоретическа€ детекци€ продуктов амплификации и секвенирование. ѕолученную расшифрованную последовательность используют в филогенетическом анализе, который состоит из этапов: предварительна€ работа с генетическими базами данных (поиск гомологии по алгоритму BLAST, составление набора данных дл€ дальнейшего анализа и др.), множественное выравнивание, определение эволюционной модели, построение филогенетического дерева, статистическа€ оценка надежности топологии дерева, интерпретаци€ результатов. јлгоритм молекул€рно-филогенетического анализа приведен на рис. 4.2.

Ц  Ц  Ц

ѕри условии того, что на данном этапе валидность таксономической принадлежности и установленных филогенетических отношений исследуемого штамма не вызывает сомнений, депонированный в генетические базы данных сиквенс считаетс€ ваучерным или референсным образцом. ѕри 100%-ном совпадении исследуемой последовательности неизвестного организма с референсным ƒЌ штрихкодом верифицированного организма, можно сделать однозначный вывод о принадлежности двух последовательностей одному виду.

—ледовательно, нет необходимости проводить дальнейший анализ (морфологический, ультраструктурный и др.) исследуемого объекта с использованием различных диагностических признаков и маркеров.

“аким образом, успешность молекул€рной идентификации в данном случае определ€етс€ наличием в генетических базах эталонов сравнени€ или ваучерных нуклеотидных последовательностей. ¬ данном случае молекул€рна€ идентификаци€ сводитс€ к процедуре ƒЌ штрихкодировани€ и включает только с 1 по 5 этапы молекул€рнофилогенетического анализа (рис. 4.2). ќднако если степень сходства менее 100%, возникают варианты принадлежности двух организмов к одному виду, к двум видам одного рода, двум родам и т.д. » так как уровни внутри- и межвидовой дивергенции завис€т от времени и скорости накоплени€ замен в нуклеотидной последовательности и дл€ разных таксонов могут существенно различатьс€, то пороговые значени€ внутри-, межвидовых и родовых различий должны устанавливатьс€ индивидуально дл€ каждой группы. », как указывалось выше, никаких универсальных диапазонов генетических различий дл€ таксонов различного ранга у зеленых водорослей не существует. —ледовательно, необходимо использовать полный алгоритм молекул€рнофилогенетического анализа (с 1 по 10 этапы, рис. 4.2).

¬ любом случае, и при отсутствии ваучерной или референсной последовательности и при ее не 100%-ной идентичности, дальнейший молекул€рно-филогенетический анализ дл€ идентификации таксона или уточнени€ его филогенетических отношений потребует от исследовател€:

- достаточно высокой степени научной квалификации в области филогенетики;

- знаний о систематическом положении изучаемого объекта;

- сведений о номенклатуре объекта (его валидное название, возможные комбинации, синонимика и др.);

- привлечени€ других видов анализа (морфологического, ультраструктурного, экологического и др.);

- необходимости работать с большим объемом выборки, желательно с широким биогеографическим охватом,

- тщательного выбора молекул€рно-генетических маркеров (см.

главу 4.2).

4.2.¬ыбор молекул€рно-генетического маркера ƒл€ таксономической идентификации зеленых водорослей и определени€ их филогенетических взаимоотношений используют целый р€д молекул€рных маркеров (“емралеева и др., 2013).

1. “радиционно €дерный ген 18S р–Ќ  €вл€етс€ главным филогенетическим маркером дл€ зеленых водорослей. ќднако использование одного этого консервативного гена часто не может обеспечить достаточной вариабельности дл€ разделени€ близкородственных видов, а, следовательно, надежно определить их таксономическую принадлежность. “ак, например, в статье ≈.¬. ћинчевой с соавт. (2013) показано, что использование 18S маркера не позвол€ет подтвердить самосто€тельный таксономический статус зеленых водорослей родов Draparnaldioides, Draparnaldia и Chaetophora, в отличие от ITS. –азграничение видов рода Chlorosarcinopsis с помощью 18S маркера также невозможно, в отличие от видов рода Bracteacoccus (Hall et al., 2010). “аким образом, использование 18S рƒЌ  целесообразно именно в филогенетических работах: дл€ разделени€ эволюционно более древних таксонов зеленых водорослей (например, в работах Aboal, Werner, 2011; Neustupa et al., 2011) или вы€влени€ новых филогенетических линий (De Wever et al., 2009; Horath, Bachofen, 2009). ¬ то врем€ как дл€ целей идентификации некоторых водорослей на уровне видов он может оказатьс€ неуспешным молекул€рным маркером.

2. √ен хлоропластной рибосомной большой субъединицы 23S (универсальный пластидный ампликон UPA) также используетс€ в молекул€рно-генетических исследовани€х зеленых водорослей. ќднако последние работы подтвердили, что он €вл€етс€ менее вариабельным, чем другие маркеры, в т.ч. и другие хлоропластные гены (Sherwood et al., 2008; Clarkston, Saunders, 2010).

3. ’лоропластный ген rbcL, кодирующий большую субъединицу фермента рибулозобифосфат-карбоксилазы, постепенно становитс€ стандартным вторым маркером дл€ зеленых водорослей после 18S рƒЌ , и, как правило, топологии филогенетических деревьев, построенных на основе этих двух маркеров, совпадают (Neustupa et al., 2013). ќднако существуют и исключени€. »ногда, топологи€ дерева на основе данных по гену rbcL отличаетс€ от таковой по гену 18S рƒЌ : например, семейство Oocystaceae на дереве rbcL не образует кластер внутри пор€дка Chlorellales (Ths et al., 2011; Novis, Visnovsky, 2012; Neustupa et al., 2013).

 роме того, не разработаны универсальные праймеры, комплементарные фрагменту данного гена, которые бы успешно амплифицировались у всех представителей отдела Chlorophyta (Nozaki et al., 1995a, 1999, 2000;

Buchheim et al., 2010). ¬следствие чрезвычайной вариабельности rbcL у зеленых водорослей он не €вл€етс€, по сути, универсальным геном.  ак альтернатива rbcL были предложены другие пластидные гены: matK, кодирующий матуразу  , rpoB и rpoC1, кодирующие субъединицы –Ќ полимераз, и межгенный спейсер trnH-psbA, расположенный между генами гистидиновой т–Ќ  и геном, контролирующим синтез белка D1 фотосистемы II (ћатвеева и др., 2011). ¬ работе Ћ.  елли с соавт. (Kelly et al., 2010) показано, что локусы matK и rpoC1 €вл€ютс€ наиболее вариабельными у водных растений семейства Podostemaceae. –абоча€ группа по изучению ƒЌ -штрихкодировани€ растений (CBOL Plant Working Group, 2009) рекомендовала использовать в качестве молекул€рных маркеров наземных растений rbcL и matK. ќднако пока не удалось амплифицировать matK у зеленых водорослей (Pombert et al., 2005; Buchheim et al., 2011) и мхов (von Crutlein et al., 2011).

4. √ен tufA, кодирующий фактор элонгации белкового синтеза хлоропластов, был предложен относительно недавно и исследован в основном у морских зеленых водорослей (Fama et al., 2002). ¬ целом, геномы хлоропластов полезны дл€ филогенетических реконструкций вследствие относительно высокого содержани€ генов и более плотной их упаковки.  роме того, в отличие от многих €дерных генов, которые €вл€ютс€ по своей природе мультикопийными (представлены в геноме несколькими паралогами, отличающимис€ между собой по первичной структуре, а иногда и по функци€м) и могут запутать филогенетическую реконструкцию, гены органелл, как правило, €вл€ютс€ однокопийными и не вызывают таких проблем (Leliaert et al., 2012).

5. ¬нутренние транскрибируемые спейсеры (ITS1 и ITS2) €дерного рибосомного оперона широко используютс€ дл€ разделени€ зеленых водорослей на видовом уровне (Verbruggen et al., 2006; Coleman, 2007;

Mei et al., 2007; Keller et al., 2008; OТKelly et al., 2010). ITS1 расположен между €дерным геном малой субъединицы рибосомы (18S) и геном 5.8S р–Ќ , ITS2 Ц между геном 5.8S р–Ќ  и €дерным геном большой субъединицы рибосомы (28S). ƒлина локуса в зависимости от таксона варьирует от нескольких сотен до более тыс€чи пар нуклеотидов. ITS1 и ITS2 вариабельны и многокопийны, что позвол€ет их легко амплифицировать у практически всех Viridiplantae с помощью одного набора универсальных праймеров (White et al., 1990).  роме того, они примыкают к консервативному участку 5.8S рƒЌ  и фланкированы консервативными генами 18S и 28S рƒЌ , что облегчает создание праймеров (Ўнеер, 2009). ѕо эффективности амплификации у зеленых водорослей ген ITS2 предпочтительнее rbcL (Buchheim et al., 2011).

ќднако к недостаткам ITS1 и ITS2 можно отнести высокую вариабельность длины и инделей, сложность в выравнивании и определении ортологичности (Feliner, Rossel, 2007; Poczai, Hyvnen, 2010). ѕодробно о применении ITS2 в качестве инструмента дл€ разграничений видов зеленых микроводорослей изложено в главе 7.

6. Ўироко используемый дл€ животных (Moore, 1995; Ferri et al., 2009; Wilson, 2010), некоторых таксонов красных (Sherwood et al., 2008;

Le Gall, Saunders, 2010), бурых (McDevit, Saunders, 2010) и диатомовых водорослей (Evans et al., 2007) 5'-фрагмент субъединицы 1 митохондриального белоккодирующего гена цитохром — оксидазы (—O1 или cox1) €вл€етс€ самым хорошо изученным из перечисленных молекул€рных маркеров. ќднако дл€ зеленых водорослей этот ген сложен дл€ амплификации (Hall et al., 2010).

¬ табл. 1 (ѕрил. 2) представлена сводна€ информаци€ о наиболее широко используемых молекул€рных маркерах и структуре праймеров дл€ различных таксонов зеленых водорослей. ≈сли сравнивать между собой все предложенные локусы, то rbcL, ITS2 и tufA обладают умеренной и сильной степенью вариабельности (Hall et al., 2010).

CO1, 18S и 23S (UPA) меньше подход€т в качестве молекул€рных маркеров:

18S и 23S рƒЌ  недостаточно вариабельные дл€ видового уровн€, а CO1 не амплифицируетс€ у большинства таксонов. ѕоэтому дл€ молекул€рногенетического анализа зеленых водорослей необходимо использовать мультилокусный или двухэтапный подход. “ак, например, монофили€ зеленых водорослей пор€дка Sphaeropleales не вызывает сомнени€, т.к.

была подтверждена как данными по вторичной структуре ITS2 (Keller et al., 2008), так и филогенетическим анализом €дерной рƒЌ  и пластидных генов atpB и rbcL (Verghese, 2007). ¬ то врем€ как филогенетические отношени€ между трем€ классами зеленых водорослей Ц Chlorophyceae, Trebouxiophyceae и Ulvophyceae Ц €вл€ютс€ спорными (Prschold, Leliaert, 2007; Zuccarello et al., 2009) и отражают, по-видимому, их древнее происхождение и быструю дивергенцию (OТKelly, 2007; Cocquyt et al., 2010). јнализ окаменелостей показывает присутствие данных классов в среднем неопротерозое, а молекул€рные часы оценивают дивергенцию данных классов в раннем неопротерозое (Butterfield et al., 1994; Douzery et al., 2004; Herron et al., 2009). ¬ некоторых ранних филогенетических работах с использованием 18S рƒЌ  показаны сестринские взаимоотношени€ между классами Chlorophyceae и Trebouxiophyceae (например, Krienitz et al., 2001), в то врем€ как последние исследовани€ с увеличенной выборкой таксонов вы€вили бльшую генетическую близость между классами Chlorophyceae и Ulvophyceae (например, Friedl, OТKelly, 2002; Watanabe, Nakayama, 2007; DeWever et al., 2009).

‘илогенетический анализ на основе хлоропластных генов, как правило, поддерживает сестринские взаимоотношени€ между Ulvophyceae и Trebouxiophyceae (Pombert et al., 2005; Turmel et al., 2009). ƒругой пример мультилокусного исследовани€ зеленых водорослей семейства Hydrodictyaceae, систематика которых до недавнего времени основывалась практически целиком на морфологических данных, также не внес €сности: ћ. Ѕухгейм с коллегами, использу€ молекул€рные маркеры 18S рƒЌ , 26S рƒЌ  и ITS2, подтвердили полифилетичность рода Pediastrum Meyen и предположили существование еще 4 дополнительных родов: Stauridium, Pseudopediastrum, Monactinus и Parapediastrum (Buchheim et al., 2005). ќднако ’. ћакманус и Ћ. Ћевис (McManus, Lewis, 2011), примен€€ дл€ молекул€рно-филогенетического анализа два молекул€рных маркера (26S рƒЌ  и rbcL), выделили только 2 рода Ц Stauridium и Monactinus и указали, что систематика родов Pediastrum, Pseudopediastrum и Parapediastrum требует уточнени€ и комплексного изучени€.

ѕоследние два примера свидетельствует о том, что до сих пор вопросы: Ђ ак перевести топологию дерева в таксономический ключ?

¬сегда ли клады, выделенные по отдельным генам, соответствуют самосто€тельным видам или другим таксонам?  акова должна быть мера различий между видами?ї Ц остаютс€ открытыми и требуют дальнейших исследований.

¬ целом, при выборе молекул€рного маркера дл€ идентификации зеленых водорослей исследователю следует учесть:

1. ¬озможность сравнени€ выбранного маркера с уже имеющимис€ в генетических базах данных последовательност€ми предположительно родственных групп на выбранном уровне таксономической детализации.

2. ƒл€ анализа таксонов со значительным уровнем дивергенции (семейства, пор€дки) нужен менее изменчивый маркер (например, 18S рƒЌ ) по сравнению с тем, который потребуетс€ дл€ изучени€ близкородственных видов (например, ITS2, rbcL). Ќеправильный выбор молекул€рного маркера может привести к необоснованному объединению или разделению таксонов, т.е. к ошибкам в идентификации.

¬ случае идентификации нового таксона при определении его филогенетического положени€ внутри отдела Chlorophyta необходимо использовать несколько независимо эволюционирующих маркеров, например €дерных и хлоропластных.  ак правило, молекул€рный анализ одного гена не обеспечивает достаточного разрешени€ дл€ установлени€ филогенетических отношений большинства организмов, а иногда дает противоречивые результаты (как отмечено в примерах выше), которые часто св€зывают с ограниченным числом выровненных нуклеотидов или с различной скоростью генетической эволюции организмов (Sunnucks, 2000). ћолекул€рный анализ, основанный на использовании нескольких генов, увеличивает филогенетическое разрешение и лучше согласуетс€ с морфологическими признаками таксона (Gontcharov et al., 2004).

4.3. –абота с международными генетическими базами данных ƒл€ видовой идентификации и установлени€ филогенетических взаимосв€зей собственные экспериментальные данные необходимо сравнить с последовательност€ми, полученными ранее другими исследовател€ми. — целью хранени€, систематизации и анализа генетической информации существует целый р€д международных баз данных или генетических банков.  ак правило, доступ к этим базам данных свободный, без регистрации. ¬ насто€щее врем€ существует ћеждународный консорциум баз данных нуклеотидных и аминокислотных последовательностей (International Nucleotide Sequence Database Collaboration), в который входит GenBank Ќационального центра биотехнологической информации —Ўј (National Center for Biotechnology Information, NCBI), EMBL-Bank ≈вропейской молекул€рно-биологической лаборатории (European Molecular Biology Laboratory, European Bioinformatics Institute) и DDBJ японии (DNA Data Bank of Japan).  роме того, существуют независимые базы данных, например, BOLDSYSTEMS (Barcode of Life Data System) Ц база данных ƒЌ -штрихкодов, PIR Ќационального биомедицинского исследовательского фонда —Ўј (Protein Identification Resource, National Biomedical research Foundation) и SWISS-PROT ”ниверситета ∆еневы и »нститута биоинформатики, Ўвейцари€ (Protein Sequence Data Bank) и др.

 аждый исследователь может не только использовать нуклеотидные или аминокислотные последовательности из генетического банка, но и депонировать собственные последовательности, создав новую запись и заполнив определенные формы с информацией о таксономическом статусе организма, характеристике локуса, авторах, публикации (если имеетс€) и т.д. ѕосле периода премодерации каждой новой генетической последовательности, поступившей в банк, присваиваетс€ идентификатор или уникальный номер (Accession number), а сама последовательность становитс€ доступна пользовател€м со всей сопровождающей ее информацией (в том случае, если автором не были установлены временные ограничени€ Ц Release Data), т.е. последовательность становитс€ аннотированной. Ћюбой генетический банк €вл€етс€ не просто местом хранени€ генетической информации, но и предоставл€ет исследовател€м различные программы и сервисы, позвол€ющие анализировать собственные и чужие данные. Ќаиболее гибкую, эффективную и всестороннюю, а потому и наиболее часто используемую, платформу дл€ доступа, депонировани€ и анализа генетической информации предоставл€ет GenBank (Benson et al., 2008). ѕоэтому остановимс€ на нем поподробнее.

GenBank позвол€ет найти и получить генетическую информацию в виде аминокислотных или нуклеотидных последовательностей различных организмов, а также сортировать эти последовательности по какому-либо признаку (характеристика локуса, конкретный таксон, автор, ключевые слова, журнал, длина последовательности, дата публикации и др.).  роме того, GenBank предоставл€ет пользователю р€д возможностей дл€ анализа собственных и депонированных другими исследовател€ми данных. ¬ первую очередь, это сравнительный анализ с помощью алгоритма BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). BLAST осуществл€ет поиск похожих последовательностей в базах данных и сравнение их с исследуемой. √лавным достоинством алгоритма €вл€етс€ скорость. ѕри этом можно сравнивать как собственно нуклеотидные последовательности, так и кодируемые ими аминокислотные последовательности. ¬ насто€щее врем€ BLAST позвол€ет учитывать вставки и делеции при поиске схожих последовательностей, использу€ алгоритмы локального выравнивани€. —емейство программ серии BLAST делитс€ на несколько групп (табл. 4.1).

Ц  Ц  Ц

–абота со всеми вариантами BLAST очень сходна. »так, вернемс€ к алгоритму, приведенному в разделе 4.1. (рис. 4.2), а именно пункту 5 Ђпредварительна€ работа с международными генетическими базами данныхї. ƒл€ идентификации неизвестного организма, использу€ методы молекул€рного анализа, мы должны сравнить полученную последовательность с последовательност€ми, хран€щимис€ в базе данных GenBank. ƒл€ начала необходимо выбрать программу, в нашем случае Ђnucleotide blastї, загрузить последовательность или файл с ней (в формате FASTA) или ввести ее идентификационный номер (ID), если она уже депонирована в GenBank (рис. 4.3).

–ис. 4.3. ¬ид поисковой страницы BLAST.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
ѕохожие работы:

Ђ”ƒ  634 ЅЅ  42.3 –24 –аспопов, √еннадий ‘едорович. –24  ак создать эко огород. —оветы врача и садовода с 40-летним стажем! / √еннадий –аспопов. Ч ћосква : »здательство "Ё", 2016....ї

Ђ“≈’ЌќЋќ√»я  ќ–ћќ¬ »  ќ–ћЋ≈Ќ»я, ѕ–ќƒ” “»¬Ќќ—“№ ”ƒ  636.2.085.16 Ќ.». јЌ»—ќ¬ј1, –.¬. Ќ≈ –ј—ќ¬1, ћ.√. „јЅј≈¬1, Ќ.¬. —»¬ »Ќ1, ¬.». „»Ќј–ќ¬1, Ќ.ј. ”Ўј ќ¬ј2 ћ» –ќЅ»ќЋќ√»„≈— »≈ ѕ–≈ѕј–ј“џ ¬  ќ–ћЋ≈Ќ»» ћќЋќƒЌя ј  –”ѕЌќ√ќ –ќ√ј“ќ√ќ — ќ“ј* √Ќ” "¬сероссийский институт живот...ї

Ђќсокина Ќаталь€ ¬асильевна ћќ–‘ќ‘»«»ќЋќ√»„≈— »≈ –≈ј ÷»» я–ќ¬ќ… “–»“» јЋ≈ » √–»Ѕќ¬ –ќƒј FUSARIUM L. Ќј ¬ќ«ƒ≈…—“¬»≈ –≈√”Ћя“ќ–ќ¬ –ќ—“ј —пециальность: 03.01.05 Ц физиологи€ и биохими€ растений 03.01.06 Ц биотехнол...ї

Ђѕќя—Ќ»“≈Ћ№Ќјя «јѕ»— ј ≈стественнонаучное образование играет ведущую роль в профессиональной ориентации обучающихс€, их подготовке к професси€м медицинского, психологического, сельскохоз€йственного направлени€. Ќе менее важна общекультурна€ и мировоззренческа€ функци€ биологического обра...ї

Ђ√ќ—”ƒј–—“¬≈ЌЌќ≈  ј«≈ЌЌќ≈ ”„–≈∆ƒ≈Ќ»≈  ≈ћ≈–ќ¬— ќ… ќЅЋј—“» √ќ—”ƒј–—“¬≈ЌЌџ… ј–’»¬  ≈ћ≈–ќ¬— ќ… ќЅЋј—“» ќЅ«ќ– ‘ќЌƒј –-1240 "–”ƒ»Ќ ¬»Ћ№ √–»√ќ–№≈¬»„ Ц заслуженный работник культуры –—‘—–, член —оюза писателей –оссии" (25.05.1925 Ц 03.06.1997 гг.)  емерово Ц 2014 ѕ–≈ƒ»—Ћќ¬»≈ јрхивные фонды личного происхождени€ Ц особа€ категори...ї

Ђ≈.¬. –юмина. ѕроблемы устойчивого развити€ 1 _ ѕ–ќЅЋ≈ћџ ”—“ќ…„»¬ќ√ќ –ј«¬»“»я: Ё ќЋќ√»„≈— ќ≈ Ќ≈ЅЋј√ќѕќЋ”„»≈ ”—“”ѕј≈“ ћ≈—“ќ Ѕ≈ƒЌќ—“»1 д.э.н. ≈.¬. –юмина »нститут проблем рынка –јЌ “руды VI ћеждународного российско-китайск...ї

ЂЅиологические науки ”ƒ  631.465 ј.ј. Ѕелоусов ќ÷≈Ќ ј ј “»¬Ќќ—“»  ј“јЋј«џ „≈–Ќќ«≈ћј ¬џў≈Ћќ„≈ЌЌќ√ќ ѕ–» –ј«Ќџ’ —ѕќ—ќЅј’ ќ—Ќќ¬Ќќ… ќЅ–јЅќ“ » ÷ель работы заключалась в исследовании вли€ни€ различных способов основной обработки на каталазную активность чернозема выщелоченного  расно€рской лесостепи.  аталазную активность...ї

Ђ”ченые записки “аврического национального университета им. ¬. ». ¬ернадского —ери€ "Ѕиологи€, хими€". “ом 27 (66). 2014. є5. —пецвыпуск. —. 165-171. ”ƒ  581.5(477.75) ќ ƒ≈Ќƒ–ќЋќ√»„≈— ќ…  ќЋЋ≈ ÷»» Ё —ѕќ«...ї

Ђ“≈’ЌќЋќ√»я ћќЋќ„Ќќ√ќ Ѕ»ќ »—≈Ћя ƒогарева Ќ.√., —тадникова —.¬. ќренбургский государственный университет, г. ќренбург ¬ насто€щее врем€ главной задачей пищевой промышленности €вл€етс€ удовлетворение физиологических потребностей населени€ в высококачественных, биологически полноценных и экологически безопасных продуктах...ї

ЂЌј”„Ќџ≈ ¬≈ƒќћќ—“» —ери€ ≈стественные науки. 2012. є 21 (140). ¬ыпуск 21 ”ƒ  575.21: 634.722 »«ћ≈Ќ„»¬ќ—“№ ћќ–‘ќЋќ√»„≈— »’ ѕ–»«Ќј ќ¬  –ј—Ќќ… —ћќ–ќƒ»Ќџ ¬ Ѕј——≈…Ќ≈ —–≈ƒЌ≈… Ћ≈Ќџ »зучена внутривидова€ изменчивость 10 к...ї

Ђћ»Ќ»—“≈–—“¬ќ ќЅ–ј«ќ¬јЌ»я » Ќј” » –ќ——»…— ќ… ‘≈ƒ≈–ј÷»» “ј“ј–— »… √ќ—”ƒј–—“¬≈ЌЌџ… √”ћјЌ»“ј–Ќќ≠ ѕ≈ƒј√ќ√»„≈— »… ”Ќ»¬≈–—»“≈“ ѕќѕќ¬ ј.ј., јЌƒ–≈≈¬ј “.¬., «ј…Ќ”ЋЋ»Ќ Ћ.». “≈ќ–»я Ё¬ќЋё÷»» (методическое пособие дл€ лабораторных зан€тий дл€ студентов, обучающихс€ по специальности "биологи€-хими€" и "биологи€-английский €зык") ћ»Ќ»—“≈–—“¬ќ ќЅ–ј«ќ¬јЌ»я » Ќј...ї

Ђѕрактические рекомендации по проведению обследовани€ и оценки состо€ни€ береговой линии, загр€зненной нефтью (по методу SCAT) ѕрактические рекомендации дл€ персонала, отвечающего за управление и ликвидацию чрезвычайных ситуаций ћеждународна€ ассоциаци€ представителей нефтегазово...ї

Ђћј–¬ј ¬. ќ√јЌяЌ ¬ј–ƒјЌ —. ќ√јЌяЌ Ё ќЋќ√»„≈— јя ћ≈ƒ»÷»Ќј ѕуть будущей цивилизации ћосква 2012 ”ƒ  572.023 ЅЅ  28.707.3 ќ-361 ќган€н ћ.¬., ќган€н ¬.—. Ёкологическа€ медицина. ѕуть будущей цивилизации. Ч 2-е изд., пер...ї

ЂЁкологи€ 4. √енеративные органы цветка / под ред. “.Ѕ. Ѕатыгиной // Ёмбриологи€ цветковых растений, терминологи€ и концепции. Ц —ѕб.: ћир и —емь€, 1994. Ц “.1. Ц 262 с.5. ≈горкина √.»., Ѕабич “.¬. –еакци€ мужского гаметофита культурных растений на загр€знение почв...ї

Ђƒепартамент культуры и национальной политики кемеро¬ской области кемеровска€ областна€ научна€ библиотека им. ¬.ƒ. ‘едорова отдел библиотечного креведени€ ƒайджест Ёкологические проблемы кемеровской области 2015 ¬ыпуск є 19 —ери€ основана в 2006 году  емерово  отышева Ќ.Ќ., главн...ї

Ђ–ќ√–јћћџ ѕ≈ƒј√ќ√»„≈— »’ институтов Ѕќ“јЌ» ј ѕ – ќ — ¬ ≈ ў ≈ Ќ » ≈ 1977 ѕ–ќ√–јћћџ ѕ≈ƒј√ќ√»„≈— »’ »Ќ—“»“”“ќ¬ Ѕќ“јЌ» ј дл€ биологических специальностей ћќ— ¬ј "ѕ–ќ—¬≈ў≈Ќ»≈" 1977  оллектив преподавателей кафедры ботаники ћ√ѕ» им. ¬. ». Ћени...ї

Ђјƒћ»Ќ»—“–ј÷»я √ќ–ќƒј  ≈ћ≈–ќ¬ќ »Ќ—“»“”“ Ё ќЋќ√»» „≈Ћќ¬≈ ј —ќ –јЌ —ери€ "—правочники по истории  узбасса". ¬ыпуск 2 ”— ќ¬ »√ќ–№ ё–№≈¬»„  ≈ћ≈–ќ¬ќ: √ќ–ќƒ— јя “ќѕќЌ»ћ»я  емерово ѕримула ЅЅ  “3(2–осЦ4 е)6€2 ” 75 –ецензенты: кандидат исторических наук...ї

Ђ√олибродо ¬асилиса јнтоновна »——Ћ≈ƒќ¬јЌ»≈  ќ√Ќ»“»¬Ќџ’ —ѕќ—ќЅЌќ—“≈… ЋјЅќ–ј“ќ–Ќџ’ ћџЎ≈… — »—ѕќЋ№«ќ¬јЌ»≈ћ √≈Ќ≈“»„≈— »’ ћќƒ≈Ћ≈… 03.03.06. Ц Ќейробиологи€ јвтореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук ћосква 2014 –абота выполнена в лаборатории физиологии и генетики поведени€ кафедры высшей нервной де€т...ї

Ђ‘≈ƒ≈–јЋ№Ќќ≈ √ќ—”ƒј–—“¬≈ЌЌќ≈ Ѕёƒ∆≈“Ќќ≈ ќЅ–ј«ќ¬ј“≈Ћ№Ќќ≈ —  –√”“»— ”„–≈∆ƒ≈Ќ»≈ ¬џ—Ў≈√ќ ѕ–ќ‘≈——»ќЌјЋ№Ќќ√ќ ќЅ–ј«ќ¬јЌ»я "–ќ——»…— »… √ќ—”ƒј–—“¬≈ЌЌџ… ”Ќ»¬≈–—»“≈“ “”–»«ћј » —≈–¬»—ј" Ћист 1 из 13 ”“¬≈–∆ƒјё ƒекан факультета подготовки кадров выс...ї

Ђѕроблемы качества и сыропригодности молока-сырь€ √Ќ” ¬Ќ»»ћ— –оссельхозакадемии «ав. отделом микробиологии, д.т.н. √.ћ. —вириденко ѕеречень нормативных документов, определ€ющих требовани€ к молоку-сырью ‘«-88 и ‘« 163 "“ехническ...ї

Ђћинистерство образовани€ и науки –оссийской ‘едерации ‘едеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образовани€ "—аратовский национальный исследовательский го...ї

Ђћинистерство образовани€ и науки –‘ ‘илиал „астного образовательного учреждени€ высшего профессионального образовани€ "ЅјЋ“»…— »… »Ќ—“»“”“ Ё ќЋќ√»», ѕќЋ»“» » » ѕ–ј¬ј" в г. ћурманске ”“¬≈–∆ƒ≈Ќќ ѕ–»Ќя“ќ ƒиректор ‘илиала на заседании кафедры социально„ќ” ¬ѕќ Ѕ»Ёѕѕ в г. ћурманске гуманитарных и естественноматематических дисциплин ј.—.  оробейников „ќ” ¬ѕ...ї

Ђ–ќ——»…— јя ј јƒ≈ћ»я Ќј”  ќтделение биологических наук »нститут проблем экологии и эволюции им. ј.Ќ. —еверцова Ќаучный совет по гидробиологии и ихтиологии “ериологическое...ї

Ђ—амарска€ Ћука: проблемы региональной и глобальной экологии. 2011. Ц “. 20, є 2. Ц —. 172-176. 595.1:599.323 √≈Ћ№ћ»Ќ“ќ‘ј”Ќј ћЋ≈ ќѕ»“јёў»’ —јћј–— ќ… Ћ” ». —ќќЅў≈Ќ»≈ 1. ∆≈Ћ“ќ√ќ–Ћјя ћџЎ№ SYLVAEMU...ї

Ђћатериалы по подготовке детей к –еспубликанскому слету юных экологов в конкурсе "«натоки природы родного кра€" ÷ель Ц оказание помощи учител€м школ, руководител€м детских объединений при подготовке детей к конкурсу "«натоки природы родного кра€" –еспубликанского слета юных экологов. ѕредставлены материалы, вызываю...ї

Ђ≈лизарьев ѕавел ¬ладимирович ¬ли€ние проход€щей транскрипции на bxdPRE Drosophila melanogaster —пециальность 03.01.07 молекул€рна€ генетика ƒиссертаци€ на соискание учЄной степени кандидата биологических наук Ќаучный руководитель: к.б.н., ≈рохин ћаксим ћаксимович ћосква Ц 2016 ќ√Ћј¬Ћ≈Ќ»≈ —ѕ...ї

Ђѕќ¬ќЋ∆— »… Ё ќЋќ√»„≈— »… ∆”–ЌјЋ. 2011. є 1. —. 36 Ц 41 ”ƒ  504.45.054-034 ¬Ћ»яЌ»≈ —”Ћ№‘ј“ј Ќ» ≈Ћя Ќј ѕ–ќ–ј—“јЌ»≈ —≈ћяЌ ¬ќƒЌџ’ –ј—“≈Ќ»… ≈. √.  рылова »нститут биологии внутренних вод им. ».ƒ....ї








 
2017 www.doc.knigi-x.ru - ЂЅесплатна€ электронна€ библиотека - различные документыї

ћатериалы этого сайта размещены дл€ ознакомлени€, все права принадлежат их авторам.
≈сли ¬ы не согласны с тем, что ¬аш материал размещЄн на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.