WWW.DOC.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Различные документы
 

Pages:   || 2 |

«РЯЗАНОВА ТАТЬЯНА КОНСТАНТИНОВНА ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПЛОДОВ И ПОБЕГОВ ЧЕРНИКИ ОБЫКНОВЕННОЙ (VACCINIUM MYRTILLUS L.) 14.04.02 – ...»

-- [ Страница 1 ] --

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«САМАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

РЯЗАНОВА ТАТЬЯНА КОНСТАНТИНОВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

ПЛОДОВ И ПОБЕГОВ ЧЕРНИКИ ОБЫКНОВЕННОЙ

(VACCINIUM MYRTILLUS L.) 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор В.А. КУРКИН Самара – 2014

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В ДИССЕРТАЦИИ

БАС – биологически активные соединения ВФС – временная фармакопейная статья ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография ВР – вспомогательные работы ГСО – государственный стандартный образец ГФ – Государственная фармакопея ДСК – диазобензолсульфокислота ЛРС – лекарственное растительное сырье НД – нормативная документация РСО – рабочий стандартный образец ТП – технологический процесс ТСХ – тонкослойная хроматография УМО – упаковка, маркировка, отправка УФ-спектр – ультрафиолетовый спектр УФ-спектроскопия – ультрафиолетовая спектроскопия ФС – фармакопейная статья ЯМР – ядерный магнитный резонанс Оглавление ВВЕДЕНИЕ



ГЛАВА 1. СОСТОЯНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ В ОБЛАСТИ СТАНДАРТИЗАЦИИ

ПЛОДОВ И ПОБЕГОВ ЧЕРНИКИ ОБЫКНОВЕННОЙ И РАЗРАБОТКИ

ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ИХ ОСНОВЕ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 14

1.1. Черника обыкновенная – перспективный источник биологически активных соединений с разнообразной фармакологической активностью

1.1.1. Этимология названия растения и историческая справка

1.1.2. Ботаническое описание растения

1.1.3. Ареал, культивирование черники обыкновенной

1.1.4. Заготовка и сушка сырья

1.1.5. Внешние признаки сырья

1.1.6. Химический состав и фармакологические свойства плодов и побегов черники обыкновенной и препаратов на их основе

1.1.7. Современное состояние морфолого-анатомических исследования лекарственного растительного сырья черники обыкновенной

1.1.8. Проблемы стандартизации сырья и лекарственных препаратов черники обыкновенной

1.1.9. Народно-хозяйственное значение черники обыкновенной

1.1.10.Перспективы создания отечественных лекарственных препаратов, обладающих антиоксидантным действием при различных офтальмологических заболеваниях

Выводы к главе 1

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.2. Методы исследования

2.2.1. Методики анатомо-гистологического анализа

2.2.2. Физические методы анализа

2.2.3. Химические методы

2.2.4. Хроматографические методы

2.2.5. Спектральные методы (УФ-, ЯМР-спектроскопия, масс-спектрометрия).. 41 2.2.6. Технологические методы

2.2.7. Титриметрические методы

2.2.8. Фармакологические методы





ГЛАВА 3. СРАВНИТЕЛЬНОЕ АНАТОМО-МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ

ИССЛЕДОВАНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ ЧЕРНИКИ

ОБЫКНОВЕННОЙ И БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ К НЕЙ ВИДОВ

3.1. Сравнительное морфологическое исследование побегов черники обыкновенной, брусники обыкновенной и толокнянки обыкновенной........... 49

3.2. Сравнительное анатомо-гистологическое исследование побегов черники обыкновенной, брусники обыкновенной и толокнянки обыкновенной........... 52

3.3. Сравнительное исследование петиолярных признаков черники обыкновенной, брусники обыкновенной и толокнянки обыкновенной........... 64 Выводы к главе 3

ГЛАВА 4. ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЧЕРНИКИ

ОБЫКНОВЕННОЙ

4.1. Сравнительное исследование химического состава плодов и побегов черники обыкновенной

4.2. Фитохимическое исследование плодов черники обыкновенной................. 87

4.3. Фитохимическое исследование побегов черники обыкновенной............... 90 Выводы к главе 4.

ГЛАВА 5. СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО

СЫРЬЯ ЧЕРНИКИ ОБЫКНОВЕННОЙ

5.1. Разработка методик качественного анализа плодов и побегов черники обыкновенной

5.1.1. Тонкослойная хроматография

5.1.2. Электронная спектроскопия

5.2. Разработка методик количественного определения суммы флавоноидов в плодах и побегах черники обыкновенной

5.2.1. Разработка методики количественного определения суммы антоцианов в плодах черники обыкновенной

5.2.2. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в побегах черники обыкновенной

5.2.3. Стабильность антоцианов при высушивании

Выводы к главе 5.

ГЛАВА 6. НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТИ РАЗРАБОТКИ

ИМПОРТЗАМЕЩАЮЩИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ

ЧЕРНИКИ ОБЫКНОВЕННОЙ

6.1. Разработка и стандартизация лекарственных препаратов на основе плодов черники обыкновенной

6.1.1. Обоснование состава и способа получения лекарственного препарата «Черники обыкновенной сироп»

6.1.2. Обоснование состава и способа получения лекарственного препарата «Черники обыкновенной таблетки»

6.1.3. Обоснование состава и способа получения лекарственного препарата «Черники обыкновенной пастилки»

6.1.4. Стандартизация лекарственных препаратов из плодов черники обыкновенной

6.2. Разработка и стандартизация лекарственного препарата «Черники обыкновенной побегов настойка»

6.3. Влияния препаратов из плодов и побегов черники обыкновенной на экскреторную функцию почек

Выводы к главе 6.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Растения являются одним из важнейших источников биологически активных соединений (БАС), находящих широкое применение в различных областях промышленности, однако особое значение имеет опыт их применения в медицине (Киселева Т.Л., 2009; Куркин В.А., 2009; Самылина И.А.

и др., 2007; Отличительной особенностью многих препаратов 2010).

растительного происхождения имеет комплексный и взаимодополняющий характер действия совокупности содержащихся в них БАС (Киселева Т.Л., 2009;

Куркин В.А., 2009; Самылина И.А. и др., 2004; 2007).

Одним из ценным источников лекарственных препаратов является черника обыкновенная (Vaccinium myrtillus L.) – растение, широко используемое в народной и официнальной медицине. Фармакопейным сырьем являются плоды и побеги (Государственный реестр лекарственных средств, 2014). Однако более широкое применение в составе препаратов на фармацевтическом рынке получили именно плоды черники благодаря разнообразию своего химического состава.

Плоды черники обыкновенной – растительное сырье, накапливающее значительное количество антоцианов, соединений, обладающих антиоксидантной, антиагрегантной, ангиопротекторной, противовоспалительной активностью).

Подобная активность антоцианов обусловливает их применение при комплексной терапии офтальмологических заболеваний (миопия, возрастная макулярная дегенерация, диабетическая ретинопатия) (Киселева Т.Н., 2007; Егоров Е.А., Побеги черники обыкновенной используются в составе 2004).

противодиабетических сборов («Арфазетин-Э», «Арфазетин-ЭК») (Государственный реестр лекарственных средств, 2014).

И для плодов, и для побегов черники обыкновенной недостаточно проработана стандартизация по группам действующих соединений. На данный момент в России существует фармакопейная статья (Государственная Фармакопея СССР ХI издания, вып. 2) только на плоды черники воздушно-сухие, в то время как в европейских странах регламентируется качество как воздушно-сухих, так и свежих плодов, при этом в качестве источника антоцианов применяются только свежие плоды.

Следует отметить, что и используемая в Российской Федерации фармакопейная статья (ФС) на плоды черники не соответствует современным требованиям к стандартам качества на ЛРС; в частности, не регламентируется количественное содержание действующих веществ, отсутствует ряд других показателей стандарт 91500.05.001-00 “Стандарты качества (Отраслевой лекарственных средств. Основные положения»). Возможно, с отсутствием содержащих современные требования стандартов качества на плоды черники обыкновенной связаны немногочисленность отечественных лекарственных препаратов на их основе и преобладание дорогостоящих импортных лекарственных средств («Стрикс», «Витрум Вижн форте»).

Качество побегов оценивают по содержанию дубильных веществ, хотя по литературным данным известно, что в побегах также содержатся флавоноиды, которые являются более лабильной группой БАС, и соответственно их содержание является более достоверным показателем качества обработки сырья.

В связи с этим актуальным является более углубленное фармакогностическое исследования плодов и побегов черники обыкновенной для обоснования подходов к стандартизации сырья, а также проведение химикофармацевтических исследований по обоснованию состава лекарственных препаратов из плодов черники. Решение поставленных задач будет способствовать реализации Стратегии развития фармацевтической промышленности Российской Федерации на период до 2020 года», утвержденной приказом Минпромторга России № 965 от 23.10.2009 г.

Цель работы и основные задачи исследования. Целью настоящей работы является фармакогностическое исследование плодов и побегов черники обыкновенной, направленное на разработку и усовершенствование методов стандартизации сырья и препаратов на их основе.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести анатомо-гистологическое исследование различных органов черники обыкновенной и других морфологически сходных видов лекарственного растительного сырья.

2. Провести сравнительное фитохимическое исследование различных органов черники обыкновенной, а также сравнение с другими морфологически сходными видами ЛРС.

3. Изучить химический состав плодов и побегов черники обыкновенной.

4. Разработать методики качественного и количественного анализа БАС в сырье черники обыкновенной.

5. Разработать проекты фармакопейных статей на черники обыкновенной плоды воздушно-сухие, черники обыкновенной плоды свежие и черники обыкновенной побеги.

6. Провести химико-фармацевтическое исследование по обоснованию состава препаратов из плодов и побегов черники обыкновенной («Черники обыкновенной сироп», «Черники обыкновенной пастилки», «Черники обыкновенной таблетки», «Черники побегов настойка»).

7. Разработать методики качественного и количественного анализа экспериментальных препаратов на основе ЛРС черники.

8. Провести фармакологические исследования по изучению влияния экспериментальных лекарственных препаратов из плодов и побегов черники обыкновенной на выделительную функцию почек крыс.

Научная новизна. С использованием оптической микроскопии получены микрофотографии, отражающие диагностические признаки побегов черники обыкновенной. Впервые проведено сравнительное анатомо-гистологическое и фитохимическое исследование побегов черники с морфологически сходными видами (толокнянка обыкновенная, брусника обыкновенная).

Из плодов черники обыкновенной выделены и идентифицированы три соединения антоциановой природы: 3-О-глюкозиды цианидина, мальвидина и дельфинидина. Впервые определен удельный показатель поглощения цианидинаО-глюкозида в 0,5% растворе аммиака в 95% спирте этиловом. Из побегов черники обыкновенной выделены и идентифицированы кверцетин-3-Оксилопиранозид, кофейная кислота и даукостерин, -ситостерин, из которых даукостерин впервые обнаружен в чернике, а кверцетин-3-О-ксилопиранозид выделен впервые из черники, произрастающей на территории Российской Федерации.

Разработаны методические и методологические подходы к стандартизации плодов свежих и воздушно-сухих, а также препаратов черники обыкновенной, заключающиеся в оценке суммы антоцианов в пересчете на цианидин-3-Оглюкозид методом прямой спектрофотометрии в 95% этиловом спирте, содержащем 1% хлороводородной кислоты. Впервые разработана методика количественного определения антоцианов в ЛРС методом дифференциальной спектрофотометрии в 0,5% растворе аммиака в 95% спирте этиловом при аналитической длине волны 623 нм на фоне исходного раствора без добавления аммиака, разведенного аналогичным образом.

Обоснованы подходы к стандартизации побегов черники обыкновенной по сумме флавоноидов в пересчете на рутин методом дифференциальной спектрометрии с алюминия хлоридом при аналитической длине волны 420 нм.

Предложен состав и способ получения лекарственных препаратов «Черники обыкновенной таблетки», «Черники обыкновенной пастилки», «Черники побегов настойка», «Черники обыкновенной сироп».

Разработаны методики анализа экспериментальных лекарственных препаратов по содержанию флавоноидов, в том числе антоцианов, с использованием методов ТСХ и спектроскопии в соответствии с принципами унификации, предъявляемыми к современному фармацевтическому анализу (Самылина И.А. и др., 1994; 2007).

Проведено изучение влияния водных и водно-спиртовых извлечений из плодов и побегов черники на экскреторную функцию почек на белых беспородных крысах. Результаты исследования показывают, что умеренным диуретическим действием обладают водные извлечения из побегов и препараты на основе свежих плодов черники. По показателям диуретической активности, натрийуреза, калийуреза и креатининуреза через 24 ч действие экстракта из свежих плодов черники обыкновенной было сравнимо с действием гипотиазида.

Под влиянием водно-спиртовых извлечений из воздушно-сухих плодов и побегов черники происходит уменьшение диуреза по сравнению с контрольной группой.

Практическая значимость. Разработаны разделы «Микроскопия», «Количественное определение», усовершенствован раздел «Качественные реакции» (ТСХ-метод и метод спектроскопии), включенные в проект фармакопейной статьи на «Черники плоды».

Предложены методики качественного и количественного анализа, определены показатели качества, которые нашли отражение в разработанных и принятых на рассмотрение ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» ФС «Черники плоды» и «Черники обыкновенной плоды свежие» и «Черники обыкновенной побеги» (вх. № 1016 от 22.01.13 г.; вх.

№ 1020 от 28.01.13 г.) с целью включения в Государственную Фармакопею Российской Федерации XII издания..

Разработаны составы и способы получения, методы стандартизации препаратов из плодов и побегов черники (таблетки, пастилки, сироп). Получен патент «Черники обыкновенной сироп (Патент РФ на изобретение № 2484671 от 20 июня 2013 г. «Сироп черники обыкновенной»; удостоверение на рационализаторское предложение № 219 от 21.09.2012 г. «Способ получения сиропа черники обыкновенной»).

Результаты диссертационных исследований используются в учебных процессах на кафедрах фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии, фармацевтической технологии, управления и экономики фармации, химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России, ГБУ здравоохранения «Центр контроля качества лекарственных средств Самарской области», ЗАО «Самаралектравы».

Связь задач исследования с планами научных работ. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научноисследовательских работ ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России (№ гос.

регистрации 01200900568).

Положения, выдвигаемые на защиту.

1. Результаты сравнительных анатомо-гистологических исследований побегов черники обыкновенной и морфологически сходных видов.

2. Результаты сравнительного фитохимического исследования плодов и побегов черники обыкновенной и морфологически сходных видов.

3. Результаты исследований по разработке методик качественного анализа плодов и побегов черники обыкновенной.

4. Результаты исследований по разработке методик количественного определения суммы флавоноидов в плодах и побегах черники обыкновенной.

5. Данные по изучению стабильности антоцианов в зависимости от условий сушки сырья.

6. Результаты исследований по разработке способов получения лекарственных препаратов на основе плодов и побегов черники обыкновенной.

7. Данные по изучению показателей качества разработанных лекарственных препаратов («Черники обыкновенной сироп», «Черники обыкновенной пастилки», «Черники обыкновенной таблетки», «Черники побегов настойка»).

8. Результаты исследований диуретической активности экспериментальных препаратов на основе плодов и побегов черники обыкновенной Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на IV Всероссийском научно-практическом семинаре для молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии.

направленный поиск новых лекарственных средств» (г. Волгоград, 2012), II Международном Конгрессе «Физическое и духовное здоровье: традиции и инновации» (г. Москва, 2012); XV, XVI, XVII Всероссийских конгрессах "Экология и здоровье человека" (г. Самара, 2010; 2011; 2012); Первой Всероссийской научно-практической конференция молодых ученых «Проблемы разработки новых лекарственных средств» (г. Москва, 2013); в финале II Всероссийского конкурса УМНИК на СТАРТ 2011 (Самарская область, сентябрь 2011); конференциях дипломированных специалистов «Аспирантские чтения» (г.

Самара, 2011; 2012; 2013).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 24 научных работах, из них 9 статей в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Личный вклад автора. Все экспериментальные результаты, приведенные в диссертации, получены самим автором. Автором выполнены исследования по изучению морфологических и анатомо-гистологических особенностей строения различных органов черни обыкновенной, в том числе в сравнительном аспекте, выявлены диагностические признаки. Из плодов черники обыкновенной выделены и идентифицированы 3 основных антоциана, из побегов черники кверцетин-3-О-ксилопиранозид, кофейная кислота и даукостерин., -ситостерин, из которых даукостерин выделен впервые, а кверцетин-3-О-ксилопиранозид выделен впервые из черники, произрастающей на территории Российской Федерации. Разработаны методики стандартизации плодов и побегов черники по содержанию флавоноидов. Изучена стабильность антоцианов при сушке плодов черники. Разработаны составы и способы получения экспериментальных лекарственных препаратов: «Черники обыкновенной сироп», «Черники обыкновенной пастилки», «Черники обыкновенной таблетки», «Черники побегов настойка». Разработаны методики их анализа, определены основные показатели качества. Изучена диуретическая активность полученных препаратов. Автором разработаны проекты ФС «Черники плоды» и «Черники обыкновенной плоды свежие», «Черники побеги».

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 159 страницах машинописного текста, содержит 30 таблиц, 59 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), обсуждения результатов собственных экспериментальных исследований (главы 3-6), общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 135 источников, из которых 47 – на иностранных языках.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, показаны научная новизна и практическая значимость полученных результатов, изложены положения, выносимые на защиту.

Первая глава посвящена обзору современного состояния исследований черники обыкновенной, в котором систематизированы сведения по изучению химического состава, фармакологических свойств, применению в медицине, стандартизации сырья и препаратов на основе данного растения.

В главе 2 приведена характеристика объектов и методов исследования.

Глава 3 отражает результаты анатомо-гистологического исследования различных органов черники обыкновенной, в том числе в сравнении.

В 4 главе приведены результаты сравнительного изучения химического состава плодов и побегов черники обыкновенной, а также морфологически схожих видов.

В 5 главе обсуждаются результаты по разработке подходов к стандартизации сырья черники обыкновенной.

В главе 6 приведены результаты исследования по стандартизации и созданию лекарственных препаратов на основе сырья черники обыкновенной, изучению их диуретической активности.

В Приложение вынесены акты внедрения, проекты ФС на черники плоды воздушно-сухие и свежие, черники побеги, патент РФ на изобретение, рационализаторское предложение.

ГЛАВА 1. СОСТОЯНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ В ОБЛАСТИ

СТАНДАРТИЗАЦИИ ПЛОДОВ И ПОБЕГОВ ЧЕРНИКИ

ОБЫКНОВЕННОЙ И РАЗРАБОТКИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

НА ИХ ОСНОВЕ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Черника обыкновенная – перспективный источник биологически 1.1.

активных соединений с разнообразной фармакологической активностью 1.1.1. Этимология названия растения и историческая справка Черника обыкновенная (Vaccinium myrtillus L., семейство Брусничные – Vacciniaceae, английские названия bilberry (чаще употребляемое), blueberry, huckleberry, whortleberry). Фармакопейными видами сырья являются плоды и побеги [8, 36].

Черника пользуется популярностью у многих народов [97, 99, 102, 103, 107]. В народе существует много названий для этого растения, в основном связанные с окраской плодов, ее красящими свойствами (ворон-ягода, чернец, чернега, горница, черняга, чернишник, черничник и др.). Растение впервые упоминается в «Буколиках» («Пастушеских песнях») древнеримского писателя Вергилия под названием Vaccinium. По мнению ученых, возможно это название латинизированное греческое Hyacinthus («гиацинт») [47]. В России род получил свое название от латинского bassa (bassinium) – «ягода» («ягодник»), впоследствии трансформировавшегося в Vaccinium. Другое объяснение этимологии этого слова связано с латинским vassa – «корова», так как некоторые виды кустарничков этого рода пригодны на корм скоту [36]. Видовое название обусловлено внешним сходством этого растения с кустарничком мирта (myrtillus уменьшительное от myrtus – «мирт»). Таким образом, дословно латинское название в переводе на русский язык звучит, как «ягодник миртоподобный» [47].

1.1.2. Ботаническое описание растения Черника обыкновенная – это невысокий ветвистый листопадный кустарничек 15-50 см [36, 48]. Стебли прямостоячие или приподнимающиеся, ветви остро-угловатые, молодые – зеленые взрослые – серые или коричневосерые. Листья очередные короткочерешковые, яйцевидные, эллиптические или почти округлые, длиной 10-25 мм шириной 8-20 мм по краю мелкопильчатые.

Корневище длинное, ползучее. Цветки мелкие, поникающие, зеленовато-белые с розоватым оттенком, расположенные по одному в пазухах листьев. Венчик кувшинчато-шаровидный, 4-5-зубчатый, андроцей представлен 8-10 тычинками, завязь 5-гнездная. Плод черники – шаровидная черно-синяя ягода с голубоватым восковым налетом и множеством продолговато-коричневых семян. Растение цветет в мае - июне, плодоносит в июле – августе (рис. 1, 2) [36, 48].

Рисунок 1 – Черника обыкновенная: Рисунок 2 – Черника обыкновенная:

фаза цветения фаза плодоношения 1.1.3. Ареал, культивирование черники обыкновенной В естественных условиях черника произрастает к северу от умеренных широт в хвойных и смешанных лесах, в лесной зоне с умеренным увлажнением и по склонам гор, образуя заросли [2, 36].

Наиболее распространенными типами леса являются ельники-черничники и сосняки-черничники. Основные заготовки ведутся в северных и Центральных районах европейской части России, Западной и Восточной Сибири. За пределами России черника обыкновенная произрастает в Белоруссии, на Украине, в странах Прибалтики, в горах и лесах европейских стран, на севере Соединенных Штатов [2, 22, 36, 134].

Кроме черники обыкновенной, существуют и другие виды черники, а также выведены разнообразные сорта. На островах Мадейра обитает черника черемухолистная, а на Кавказе, Дальнем Востоке и на севере Малой Азии произрастает третичный реликт - черника кавказская (Vaccinum arctostaphylos L.)

– кустарник или небольшое до 3 м высотой, листопадное деревце. В теплых климатических условиях плодоносить кавказская черника может несколько раз в год, плоды ее съедобны и в последнее время рассматриваются как возможные заменители официнального сырья – плодов черники обыкновенной [36, 47, 79].

Культурное разведение черники было впервые начато в США и сейчас постепенно налаживается и в России. Выведены такие культурные сорта, как черника садовая Bluecrop, черника садовая Herbert, черника садовая Spartan, черника садовая Nelson и др. [47].

1.1.4. Заготовка и сушка сырья Для лекарственных целей собирают ягоды вручную в период полной зрелости в сухую погоду утром ближе к полудню или в конце дня. Перезревшие ягоды собирать не следует, так как они легко мнутся при сушке и слипаются.

Применение ягодо-сборочных механизмов нежелательно. Собранные ягоды очищают от мха, веточек хвои и других примесей. Мыть ягоды черники нельзя [36, 55]. Сушат в конвейерных и других сушилках, вначале провяливая в течение 2-3 ч при температуре 35-40 С, а затем досушивая при температуре 55-60 С.

Высушенные ягоды не должны слипаться в комок и окрашивать ладонь.

Листья черники собирают вручную во время цветения (май – июнь), обрывая средние листья или срезая ножницами побеги с листьями. Сушка проводится тонким слоем в тени или на чердаках при хорошей вентиляции [36].

1.1.5. Внешние признаки сырья Фармакопейным сырьем у черники являются плоды и побеги [8, 9].

Плоды черники обыкновенной представляют собой шарообразные черные ягоды с сизым налетом, реже приплюснутые или несколько удлиненные, 6-8 мм в диаметре, с блюдцевидным широким вдавлением на верхушке – диском, окаймленным остатком чашечки; мякоть темно-пурпуровая с красным соком [8, 36, 55]. В мякоти плода имеются многочисленные (до 30 штук) семена яйцевидной формы. У основания иногда имеется короткая плодоножка.

Цвет плодов с поверхности черный с красноватым оттенком; матовый или слегка блестящий; мякоти – красно-фиолетовый; семян – красно-бурый. Запах слабый. Вкус кисло-сладкий, слегка вяжущий [48].

В высушенном состоянии это ягоды диаметром 3-6 мм, бесформеннее, сильно сморщенные, в размоченном виде шаровидные. На верхушке плодов виден остаток чашечки в виде небольшой кольцевой оторочки, окружающей вздутый диск с остатком столбика в центре или с небольшим углублением после его отпада [8, 36]. Цвет плодов с поверхности черный с красноватым оттенком;

матовый или слегка блестящий; мякоти – красно-фиолетовый; семян – краснобурый. Запах слабый. Вкус кисло-сладкий, слегка вяжущий [8].

Побеги черники представляют собой смесь цельных или изломанных верхушек побегов, отдельных стеблей, листьев, реже бутонов, цветков и плодов.

Стебли длиной до 150 мм. Вкус сырье горьковато-вяжущий [82].

Измельченное сырье - кусочки листьев, стеблей, изредка бутонов, цветков и плодов, проходящие сквозь сито с отверстиями размером 2 мм. Цвет светлозеленый, зеленый или коричневато-зеленый. Запах слабый. Вкус водного извлечения горьковато-вяжущий. При рассмотрении под лупой видны голые, слегка блестящие, светло-зеленые, зеленые или коричневато-зеленые кусочки листьев и остро-ребристые, зеленые или коричневато-зеленые кусочки стеблей [9, 82].

1.1.6. Химический состав и фармакологические свойства плодов и побегов черники обыкновенной и препаратов на их основе Многообразие фармакологических свойств черники обыкновенной обусловлено целым комплексом биологически активных веществ [36, 134]. В настоящее время ведущей группой биологически активных соединений рассматриваются конденсированные дубильные вещества (до 12%) на основе галлокатехина, эпикатехина, эпигаллокатехина, обеспечивающих вяжущее, антисептическое, противовоспалительное действие плодов [8, 36].

Но возросший в последнее время интерес к плодам черники связан с их способностью улучшать зрение. Это их действие ассоциируют с наличием в ней антиоксидантов из группы биофлавоноидов и в первую очередь антоцианов. По литературным данным содержание антоцианов колеблется от 300 до 700 мг% [105].

В плодах было идентифицировано 14 антоцианов, представленных 3-Оарабинозидами, 3-О-глюкозидами и 3-О-галактозидами пяти антоцианидинов:

цианидина, дельфинидина, петунидина, пеонидина и мальвидина [36, 95, 108].

Антоцианы являются более лабильной группой, легко разрушающейся под действием света, высокой температуры, высоких значениях рН [89, 108]. Поэтому, в соответствии с современной концепцией о ведущей группе БАС, предложенной В.А. Куркиным, под которой следует понимать «наиболее уязвимую, с точки зрения фармакогнозии, на всех стадиях технологического процесса – от «грядки»

до лекарственной формы» [36, 62], возможен пересмотр отнесения черники к классу дубильных веществ.

Кроме антоцианов, в плодах черники обнаружены такие флавоноиды, как рутин, гиперозид, изокверцитрин и др. (табл. 1). В качестве сопутствующих веществ содержатся сахара (глюкоза, фруктоза, сахароза) (5-20%); органические кислоты (лимонная, щавелевая, яблочная. янтарная, хинная, молочная (5 – 7%); до 6 мг% витамина С, витамины группы В, каротин, простые фенолы (арбутин, метиларбутин), пектиновые вещества [36].

–  –  –

В химический состав плодов черники входят ценные микроэлементы.

Особенно велико содержание марганца и железа. Соотношение этих компонентов приемлемо для применения плодов в патогенетической терапии железодефицитной анемии [25].

Листья содержат практически те же вещества, что и плоды, но значительных количеств достигает содержание витамина С (до 250 мг%), также много конденсированных дубильных веществ (7-20%), имеются и другие фенольные соединения - гидрохинон (1%), арбутин (1-2%), флавоноиды.

Гипогликемическое действие побегов черники объясняется присутствием неомиртиллина, о химической структуре которого не существует однозначного мнения. Первоначально под «неомиртиллином» понимали комплекс фенольных соединений (в том числе антоцианов), имеющихся также и в плодах, но применение благодаря своему инсулиноподобному действию нашли только побеги черники. Существует версия, что сахаропонижающее действие связано с шестиатомным циклическим спиртом [36, 47].

1.1.7. Современное состояние морфолого-анатомических исследования лекарственного растительного сырья черники обыкновенной В Российской Федерации в существующей фармакопейной статье на плоды черники обыкновенной [8] отсутствует раздел «Микроскопия». Проблема подтверждения подлинности плодов черники обыкновенной в зарубежных фармакопеях проработана достаточно глубоко. Описание анатомогистологических признаков приводится в Европейской Фармакопее и Американской растительной фармакопее.

Следует отметить, что ранее на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии была проведена работа по сравнительному морфологоанатомическому исследованию плодов, содержащих антоцианы [17, 18, 19, 31].

Результаты данных исследований были использованы при составлении проектов фармакопейных статей.

При описании отмечаются такие признаки, как полигональные клетки эпидермиса, покрытые толстым слоем кутикулы. Клетки эпидермиса сгруппированы в комплексы, отграниченные друг от друга более толстыми клеточными стенками, чем в границах комплекса. Экзокарп состоит из клеток с тонкими стенками, встречаются склереиды и сосудистые пучки со спиральными сосудами. В эндокарпе встречаются удлиненные склереиды с толстыми пористыми стенками, как правило, расположенные группами. Встречаются кристаллы оксалата кальция. Эпидермис семени состоит из характерных Uобразных клеток.

В научной литературе и нормативной документации имеются данные и по анатомо-гистологическим признакам побегов черники обыкновенной [48, 65, 82].

Отмечаются такие признаки, как наличие толстостенных прямых волосков с грубой бородавчатой поверхностью, булавовидных железок на обеих сторонах листовой пластинки, кристаллоносная обкладка вдоль жилок.

Однако по-прежнему остается актуальным проведение сравнительного анатомо-гистологического исследования побегов черники обыкновенной с близкородственными видами, получение цифровых микрофотографий диагностических признаков в соответствии с требованиями ОСТ 91500.05.001-00 "Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения" к фармакопейным статьям на лекарственное растительное сырье и включение полученных данных в стандарт качества на исследуемое лекарственное растительное сырье.

Кроме этого, в последнее время получила распространение петиолярная анатомия [32, 33, 34, 35, 41, 54, 69], которая позволяет проводить диагностику близкородственных видов. Однако информации по строению черешков черники обыкновенной, особенно в сравнительном плане с другими видами, в литературных данных не обнаружено.

1.1.8. Проблемы стандартизации сырья и лекарственных препаратов черники обыкновенной В настоящее время качество лекарственного растительного сырья «Плоды черники обыкновенной» в Российской Федерации регламентируется Государственной Фармакопеей ХI издания (ФС 35) [8]. На побеги черники существуют фармакопейные статьи предприятий [82].

Однако фармакопейная статья на плоды черники обыкновенной не соответствует современным требованиям к стандартам качества лекарственных средств. В ней отсутствует раздел «Микроскопия». Не оценивается содержание действующих веществ. Раздел «Числовые показатели» предусматривает только определение влажности, золы общей и нерастворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты и другие показатели, которые не отображают качество ЛРС. Подлинность сырья оценивается с помощью пробирочных реакций, в то время как в настоящее время существуют другие, более специфичные методы анализа [8].

Требования Американской растительной фармакопеи 2001 г. включают в себя те же числовые показатели, а также содержание экстрактивных веществ, которых должно быть не менее 50% [79].

В Европейской фармакопее предусматривается оценка качества сырья с использованием метода тонкослойной хроматографии, указаны диагностические микроскопические признаки плодов. Регламентируется содержание общей суммы антоцианов в пересчете на цианидин-3-глюкозид хлорид (хризантемин) (не менее 0,3%), которое определяется спектрофотометрически [101].

Лекарственными средствами из черники обыкновенной, применяемыми на территории Российской Федерации, являются «Черники обыкновенной плоды», «Черники обыкновенной побеги», побеги черники входят в состав сборов «Арфазетин-Э» (Красногорсклексредства), «Арф-Э» (Фитофарм). Также зарегистрирован гомеопатические препарат «Миртикам» [9]. В основном распространены биологически активные добавки («Черника-форте», «Окувайт» и др.), требовании к которым значительно ниже, чем к лекарственным препаратам, и поэтому велика вероятность фальсификации.

1.1.9. Народно-хозяйственное значение черники обыкновенной Значимость в сознании людей этого растения отражает красивая легенда, повествующая о том, что волшебными и уникальными свойствами наделили чернику гномы в благодарность за убежище от различных опасностей, предоставленное им черничным лесочком [47].

Столь большая популярность ягод черники в народе связана не только с ее вкусом и красящими свойствами, но и значимостью ее как лечебного средства. На Руси издавна существовало поверье, что в доме, где едят чернику, врачу делать нечего [47].

Впервые лечебные свойства черники описали Плиний и Диоскорид (I в. н.

э.), указавшие на ее ценные лечебные свойства при терапии желудочных заболеваний. В ХVI знахарь Калпеппер отметил положительное влияние плодов черники на печень и желудок, при хроническом кашле, заболевании легких.

Чернику стали активно применять при острых и хронических расстройствах желудочно-кишечного тракта, колитах, энтероколитах, дизентерии, а также местно – при стоматитах и гингивитах (вяжущее и антисептическое действие).

Отвар из плодов – нежное вяжущее лекарственное средство, применяемое при расстройствах функции желудочно-кишечного тракта, особенно ценное в детской практике. Ягоды применяются также при циститах [47].

В годы Второй Мировой войны английские летчики употребляли черничный джем с целью улучшения зрения в сумерках. Черника давно входит в обязательное меню космонавтов [47, 115]. Такое действие плодов черники в большей степени обусловлено содержащимся в них комплексов антоцианов, многообразные фармакологические эффекты которых перечислены выше. Из-за своего положительного воздействия на зрение плоды черники входят в состав биологически активных добавок (Черника-форте, Окувайт, Черника с селеном и др.).

Входящие в состав черники антоцианы применяются в пищевой промышленности в качестве красителей (Е163) [42, 75, 83]. Объединенный экспертный комитет по пищевым добавкам Всемирного общества здравоохранения (ВОЗ) оценивает антоцианы как нетоксичные для организма человека и не ограничивает их потребление [115, 120, 127]. Кроме того, безопасность антоцианов подтверждают исследования их токсичности, а также клинические испытания [115]. Доказано, что антиоксидантная активность антоцианов более выражена, чем у альфа-токоферолов, аскорбиновой кислоты, каротина, и сравнима с синтетическими антиоксидантами бутилгидроксианизолом и бутилгидрокситолуолом [98, 112].

Антоцианы обладают и антимикробными свойствами. Например, они препятствуют адгезии микроорганизмов к слизистой мочеполового тракта. Для них обнаружена и гепатопротекторная, противоязвенная активность.

Упоминаются и эстрогеноподобные свойства антоцианов [98, 112].

Имеются сведения о проявлении антоцианами противоопухолевой активности [119]. Для цианидина-3-глюкозида и пеонидина-3-глюкозида было выявлено потенцирование действия доксорубицина и снижения его токсической дозы на модели клеток линий рака легких. Антоцианы с о-дигидроксильной группировкой в кольце В (цианидин, пеларгонидин, дельфинидин) обладают большей противоопухолевой активностью по сравнению с другими (мальвидин, пеонидин, петунидин), что коррелирует с их антиоксидантной активностью [100, 119].

Клинические исследования показали положительный эффект применения антоцианов при терапии ломкости капилляров, тромбоцитарной пурпуре, нарушении кровообращения головного мозга, венозной недостаточности, варикозной заболевании вен. Эти эффекты связаны со стабилизацией мембранных фосфолипидов и увеличением восстановления соединительной ткани, окружающей сосуды. При употреблении черничного экстракта в количестве 480 мг/день 47 пациентов были вылечены от варикоза вен [98].

Благодаря разнообразным фармакологическим эффектам антоцианы нашли клиническое применение. В настоящее время в европейских странах применяется стандартизованный 25% экстракт из плодов черники, применяемый в офтальмологии (для улучшения ночного зрения, лечения катаракты, макулярной дегенерации, диабетической ретинопатии), для лечения васкулярных расстройств, а также пептических язв, дисменореи. В нашей стране на основе лекарственного растительного сырья, содержащего антоцианы, пока производятся только биологически активные добавки [97, 98].

Действующие вещества побегов черники обладают инсулиноподобным действием, вследствие чего входят в состав сборов, применяемых при сахарном диабете (Арфазетин) [9, 36].

Черника находит широкое применение и в других отраслях. Она широко используется в пищевой промышленности, из ягод приготовляют вино, кисель, соки, экстракты; сок черники – пищевой краситель при производстве плодовых вин, безалкогольных напитков [80].

Надземную часть используют для дубления и окрашивания кожи в коричневый и желтый цвета, из жмыха получают краситель, окрашивающий ткани, шерсть, шелк в красный и фиолетовый цвета. Раньше из черничного сока изготовляли пурпурные и фиолетовые краски для художников. Само растение прекрасный медонос [47].

–  –  –

Рисунок 3 – Лекарственные формы офтальмологических лекарственных средств.

Отечественные лекарственные препараты имеют более низкие ценовые характеристики по сравнению с зарубежными. Наибольшее количество зарегистрированных торговых наименований российских производителей (24% от общего количества присутствующих на рынке средств, назначаемых при болезнях глаз и его придаточного аппарата) имеют средние цены по Самарской области до 50 руб. Импортные препараты в основном имеют цену в диапазоне от 100 до 300 руб. [52] (рис. 4).

30,00% 25,00%

–  –  –

По происхождению преобладают препараты синтетического происхождения (примерно 80%); по количеству компонентов – монопрепараты (85,0%). Доля средств растительного происхождения составляет 5,4% [52].

По объему продаж в денежном выражении из импортных препаратов лидируют ЛС бельгийского, канадского и индийского производства (рис. 5).

–  –  –

Следует отметить, что в группе А 5% от выручки приходится на препараты («Стрикс», «Витрум вижн форте»), содержащие антоцианы – природные антиоксиданты [52].

Следует отметить, что практически при всех офтальмологических заболеваниях, особенно ассоциированных с сердечно-сосудистой патологией, требуется дополнительное применение лекарственных препаратов с антиоксидантной, нейропротективной, антиагрегантной активностью, способностью ускорять регенеративные процессы [16, 17, 21, 26, 29, 44, 50, 56, 59].

Обзор литературы показывает, что выраженными антиоксидантными свойствами обладают лекарственные препараты, получаемые из растительного сырья, содержащие различные биофлавоноиды, в том числе антоцианозиды [16, 21, 26, 56, 133]. Хорошо себя зарекомендовали лекарственные средства, содержащие антоцианозиды плодов черники [16, 79, 98,. 134]. Данные вещества обладают противовоспалительным и антиоксидантным действием [133]. Они способствуют улучшению реологических свойств крови (снижая тонус сосудистой стенки и уменьшая тромбообразование), способствуют укреплению стенки кровеносных сосудов (эффект обусловлен способностью данных веществ влиять на регуляцию биосинтеза коллагена), а также ускоряют восстановление обесцвеченного родопсина [97, 98, 112]. Препараты на основе плодов черники могут использоваться при возрастной макулярной дегенерации, миопии, при «компьютерном зрительном синдроме, положительный эффект наблюдался в комплексном лечении диабетической ретинопатии, нейропротективной терапии первичной открытоугольной глаукомы [16, 17, 21, 26, 44]. Из препаратов, содержащих антоцианозиды плодов черники, Межрегиональной ассоциацией врачей-офтальмологов рекомендован Миртилене форте (производитель S.I.F.I., Италия) [16].

В настоящее время на фармацевтическом рынке присутствует значительное количество биологически активных добавок на основе плодов черники, которые пользуются большой популярностью (более 50 наименований, лидеры продаж «Черника форте с витаминами и цинком», «Черника форте с лютеином» (ЗАО «Эвалар»)) [3, 52, 86]. Однако ассортимент лекарственных средств, содержащих антоцианы плодов черники, представлен в основном импортными препаратами («Стрикс» (Дания, Ферросан, стоимость 350-450 руб.), «Витрум вижн форте»

(США, Unipharm Inc., стоимость №30 - 350-500 руб., №60 – 550-700 руб.), «Миртилене форте» (Италия, S.I.F.I., стоимость 1100-1200 руб.)), хотя ареал черники в РФ достаточно обширен; из отечественных представлен только гомеопатический сироп «Миртикам» (000 "Камелия НПП", стоимость 200-250 руб.) [9, 52, 53].

Следует отметить, что в настоящее время фармакопейным сырьем являются воздушно-сухие плоды черники обыкновенной [8], в то время как антоцианы являются очень лабильными соединениями и легко разрушаются под воздействием высоких температур, воздействия света и т.п. [90, 91, 122]. В Европейской Фармакопее имеются отдельные монографии на свежие плоды черники (источник антоцианов) и воздушно-сухие (источник дубильных веществ) [101].

Все это обусловливает необходимость регистрации в качестве фармакопейного лекарственного растительного сырья свежие плоды черники и разработки отечественного импортозамещающего лекарственного препарата на основе свежих плодов.

Выводы к главе 1

1. Анализ данных литературы показал, что в настоящее время применение плодов черники обыкновенной в основном обусловлено содержащимися в них антоцианами – природными антиоксидантами с широким спектром фармакологической активности. Воздушно-сухие плоды черники являются источником дубильных веществ конденсированной группы и используются как мягкое вяжущее в педиатрии. Биологически активными соединениями побегов черники являются флавоноиды, дубильные вещества, фенилпропаноиды.

2. Фармакопейным сырьем в Российской Федерации являются побеги и воздушно-сухие плоды черники обыкновенной, в то время как в европейских странах в качестве ЛРС используют также свежие плоды для получения 25% экстракта. Применение свежих плодов обусловлено тем, что антоцианы являются лабильными соединениями и их потери при сушке могут достигать 60%. В связи с этим актуальным представляется разработка показателей качества и фармакопейной статьи для свежих плодов, а также в отличие от европейских стандартов стандартизация как свежего, так и воздушно-сухого сырья по содержанию антоцианов как наиболее лабильной группы биологически активных соединений.

4. Заболеваемость болезнями глаз и его придаточного аппарата в Российской Федерации достаточно высока; имеется потребность в эффективных и безопасных средствах с антиоксидантной, нейропротективной, капилляроукрепляющей активностью при различных офтальмологических расстройствах (миопия, возрастная макулярная дегенерация, диабетическая ретинопатия, др.) с целью их профилактики и предотвращения осложнений.

.5. В настоящее время рыночный ассортимент лекарственных средств на основе плодов черники представлен в основном препаратами зарубежного производства («Стрикс», «Миртилене форте»), несмотря на то, что в Российской Федерации достаточно ресурсов для производства отечественных препаратов. Целесообразным представляется разработка отечественных импортозамещающих препаратов на основе черники обыкновенной с антиоксидантной активностью.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования 2.1.

Объектами исследования служили образцы сырья – плодов и побегов черники обыкновенной (Vaccinium myrtillus L., сем. Брусничные – Vacciniaceae), побегов брусники обыкновенной (Vaccinium vitis-idaea L., сем. Брусничные – Vacciniaceae) и побегов толокнянки [Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng., сем.

Вересковые – Ericaceae], заготовленные в период с 2012 по 2013 гг. Растения заготавливались на территории Пензенской области, Республики Марий Эл и др.

Образцы сырья были собраны в различной фазе вегетации.

Образцы лекарственного растительного сырья:

побеги черники обыкновенной, заготовленные в Пензенской области, Сосновоборский район, пос. Сосновоборск, 2012 г.;

побеги черники обыкновенной, заготовленные в Республике Марий Эл, Волжский район, г. Волжск, 2013 г.;

побеги брусники обыкновенной, заготовленные в Республике Марий Эл, Волжский район, г. Волжск, 2013 г.;

побеги толокнянки обыкновенной, заготовленные в Республике Марий Эл, Волжский район, г. Волжск, 2012 г.;

заводские образцы побегов черники обыкновенной (ООО «Алтайфарм», г. Барнаул);

свежезамороженные плоды черники (ЗАО «Хладокомбинат западный», Московская область, г. Одинцово, ТУ 9165-002-47569210-00;

образцы плодов из разных регионов РФ (Алтайский край, республика Татарстан);

плоды черники воздушно-сухие (ООО ПКФ «Фитофарм» (г. Анапа, Краснодарский край), ЗАО «Иван-Чай» (г. Москва)).

–  –  –

2.2.1. Методики анатомо-гистологического анализа Образцы исследуемого лекарственного растительного сырья выдерживали в горячей воде на кипящей водяной бане, фиксировали в смеси спирта этилового 96%, глицерина ректифицированного и воды очищенной в соотношении 1:1:1.

Экспозицию объекта проводили в течение суток, после чего подвергали анатомогистологическому анализу.

Приготовление микропрепаратов осуществляли в соответствии с фармакопейной методикой микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья [7, с. 279; 14]. Препараты кожуры и околоплодника с поверхности, поперечные срезы плодов и семян в ряде случаев готовились также с нативного сырья.

Окраску микропрепаратов осуществляли следующими способами:

1. Окрашивание одревесневших (лигнифицированных) оболочек клеток.

Срезы на предметном стекле помещали в каплю раствора сернокислого анилина, накрывали покровным стеклом. Наблюдали окрашивание одревесневших оболочек клеток в желтый цвет.

2. Окраска жирного масла. Срезы на часовом стекле помещали в каплю раствора Судана III на 10-20 мин, затем промывали водой и переносили на предметное стекло в каплю глицерина. Наблюдали окрашивание капель жирного масла в желто-оранжевый цвет.

Реактивы готовились в соответствии с методиками, изложенными в [7, 13, 51].

Так как объектами исследования являлись плоды, содержащие антоцианы, то на препаратах, приготовленных с нативного сырья, была проведена качественная реакция на эти соединения – с разбавленным раствором натрия гидроксида.

2.2.2. Физические методы анализа Плотность образцов сиропа определяли с использованием набора ареометров общего назначения ИСП.АI (ГФ XII, ч.1, с. 40, метод 3).

Величину рН измеряли при помощи электронного рН-метра «МР-225» (ГФ XII, ч.1, с. 89-90).

Оценка внешнего вида таблеток проводилась визуально на наличие дефектов размера, цвета, поверхности (наличие выступов, сколов, крошений, царапин, слипаний и др.).

Механическую прочность таблеток определяли с помощью устройства для истирания таблеток барабанного типа – фриабилляторе при скорости вращения 20 об/мин. 10 таблеток, предварительно обеспыленных и взвешенных с точностью до 0,001 г, помещали в барабан, привинчивали крышку и включали прибор на 5 мин (100 оборотов барабана). По истечении установленного времени таблетки обеспыливали и определяли массу с точностью до 0,001 г.

Прочность таблеток на истирание определяли по формуле:

Рнач Ркон П 100 100 ;

Рнач где Рнач; Ркон – масса таблеток до и после испытания соответственно, г.

Для определения распадаемости таблеток использовался идентификатор распадаемости таблеток (Erweka) (рис. 8). Прибор состоит из сборной корзинки, сосуда для жидкости вместимостью 1 л, термостатического устройства, поддерживающего температуру 37±2С и электромеханического устройства, сообщающего корзинке возвратно-поступательное движение в вертикальной плоскости при частоте 28-32 цикла в 1 мин. Корзинка снабжена 6 направляющими дисками, вставленными в стеклянные трубки. Испытание проводили на 6 образцах. Если 1 или 2 таблетки не распадались, испытание проводили на 12 образцах. Норма распадаемости для обычных таблеток – 15 мин. Этот метод позволяет косвенно судить о времени распадаемости таблеток в желудочнокишечном тракте.

Среднюю массу таблеток определяли путем взвешивания 20 таблеток с точностью до ±0,0001 г. Массу отдельных таблеток определяли взвешиванием порознь 20 таблеток с точностью до ±0,0001 г. Допустимые отклонения для таблеток массой 0,3 г и более ±5% от средней массы таблеток.

2.2.3. Химические методы При проведении фитохимического исследования нами использовались следующие пробирочные реакции:

1. Цианидиновая реакция (проба Shinoda). К 1-2 мл исследуемого образца прибавляют 5 капель концентрированной хлористоводородной кислоты и 5-10 мг магния. Образуется красно-малиновое окрашивание (флавоноиды) [36, 84].

2. Цианидиновая реакция по Брианту (продолжение первой реакции).

Раствор, полученный в реакции 1, разбавляют водой и обрабатывают изоамиловым спиртом. При наличии агликона окраска переходит в органическую фазу, а при наличии гликозида – остается в водном растворе [36, 84].

3. В пробирку помещают 2 мл исследуемого препарата, прибавляют 2 мл 1раствора алюминия хлорида (III), образуются окрашенные соединения (желтого цвета), имеющие желто-зеленую флуоресценцию при длине волны 366 нм (батохромный сдвиг) (флавоноиды, фенольные соединения) [36, 84].

4. Борно-лимонная реакция (реакция Вильсона). К 1-2 мл исследуемого образца прибавляют 1-2 капли раствора борной кислоты в присутствии лимонной (или щавелевой) кислоты. Образуется ярко-желтое окрашивание с желто-зеленой флуоресценцией (образование батохромного комплекса). В случае участия в реакции 3-ОН-группы образуется устойчивый (пятичленный) комплекс, который не разрушается при добавлении лимонной или щавелевой кислоты [36, 84].

5. Реакция с диазореактивом (диазобензолсульфокислота – ДСК в щелочной среде). К 1-2 мл исследуемого образца прибавляют 1-2 капли раствора ДСК.

Раствор окрашивается в желтый цвет [36, 84].

6. Кислотный гидролиз. 10 мг гликозида нагревают с 3 мл 2% раствора НСl на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Полноту гидролиза проверяют методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Из охлажденной смеси отфильтровывают кристаллы агликона через взвешенный стеклянный фильтр.

Водный раствор упаривают в вакууме и используют для идентификации углеводов [36, 84].

2.2.4. Хроматографические методы

2.2.4.1. Тонкослойная хроматография В процессе разделения хроматографическим методом в тонком слое сорбента анализируемая смесь перемещается с подвижной фазой по тонкому слою порошкообразного сорбента, закрепленным на стеклянной, алюминиевой или полимерной подложке. Хроматографическое разделение основано на различиях в их скоростях миграции. В основе механизма разделения лежит характер взаимодействия между растворенными веществами и твердой или жидкой фазами, с которыми они соприкасаются (адсорбция, ионный обмен, распределение между жидкостями подвижной и неподвижной фаз). Для обнаружения соединений на пластинках используются физические (флуоресценция при облучении с длиной волны 254 и 366 нм), химические, биологические и комбинированные методы [27].

В исследовании ТСХ-разделение проводили на хроматографических пластинках “Силуфол УФ-254”, “Сорбфил-ПТСХ-П-А-УФ” или «Сорбфил ПТСХАФ-А-УФ». Пластинки предварительно выдерживали для активации в сушильном шкафу при температуре 100-105 С в течение 1 часа. Пробы наносили микропипеткой на линию старта, проведенную на расстоянии 1,5 см от нижнего края пластинки вдоль линии накатки, так чтобы пятна отстояли друг от друга на расстоянии около 1 см. После нанесения проб пластинку высушивали на воздухе в течение 5 мин, затем помещали в предварительно насыщенную парами растворителей камеру и хроматографировали восходящим способом в различных системах (хлороформ-метанол-вода 26:14:3; хлороформ-этанол-вода 26:16:3;

хлороформ-0,1% спиртовой раствор НСl - вода 26:16:3, 1% спиртовой раствор НСl; н-бутанол - ледяная уксусная кислота-вода 4:1:2; 4:1:5 (верхняя фаза) и др.).

Когда фронт растворителей проходил около 8-9 см, пластинку вынимали и сушили на воздухе в течение 5-10 минут до удаления запаха растворителей.

Детекцию проводили в видимой области спектра и в УФ-свете (254 и 366 нм), а также после обработки раствором диазобензолсульфокислоты в насыщенном растворе натрия карбоната.

2.2.4.2. Адсорбционная жидкостная колоночная хроматография В основе разделения методами адсорбционной жидкостной хроматографии лежит адсорбция - физическое взаимодействие между молекулами пробы (сорбата) и неподвижной фазы (сорбента), а также между молекулами подвижной фазы (элюента) и сорбента [21, 40].

При исследовании химического состава плодов черники в качестве исходного материала для нанесения на сорбент использовали сок плодов, нестабилизированный. После отжима свежих плодов (50,0 г) их промывали небольшим объемом 95% спирта. Полученный сок упаривали в роторновакуумном испарителе при температуре 60±2 °С. Сгущенный сок высушивали при комнатной температуре на сорбенте Silica gel для хроматографии L 40/100 (20,0 г).

Для заполнения колонок использовали суспензионный метод. В хроматографическую колонку на предварительно сформированный в хлороформе слой сорбента (толщина слоя сорбента 7 см, диаметр 4,5 см) переносили порошок (сок + сорбент). Элюирование проводили в градиентном режиме смесями хлороформа и этилового спирта, содержащего 0,1% хлористоводородной кислоты (хлороформ, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%-ное содержание подкисленного этилового спирта в хлороформе, подкисленный этиловый спирт). Фракции собирали объемам по 100 мл; упаривали в роторно-вакуумном испарителе при температуре 50±2°С до остаточного объема 5-6 мл.

Целевые фракции, содержащие антоцианы, рехроматографировали на полиамиде (полиамид «Woelm») в градиентном режиме от хлороформа к метанолу и ступенчатом увеличении значения рН. Для этого объединенные упаренные фракции наносили на слой полиамида (толщина слоя 3 см; диаметр – 2 см. В качестве элюентов использовались хлороформ, смеси хлороформа и метанола, содержащего 0,1% хлористоводородной кислоты, в различных соотношениях (9:1; 8:2; 7:3; 6:4; 1:1; 4:6); подкисленный метанол.

Ход хроматографического разделения контролировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) в нескольких системах с использованием различных способов детекции (визуально в видимой области; в УФ-свете при длине волны 254 и 366 нм).

Фракции, содержащие преимущественно индивидуальные антоцианы, объединяли и упаривали при комнатной температуре до сухого остатка.

Структуру веществ определяли с использованием методов спектроскопии ядерномагнитного резонанса и масс-спектрометрии.

С целью изучения химического состава побегов получали настойку из побегов черники в соотношении «сырье – экстрагент» 1:5 с использованием в качестве экстрагента 70% этилового спирта. Полученную настойку упаривали и смешивали с силикагелем L40/100 (Чехия), высушивали до получения сыпучего порошка. Хроматографическое разделение проводили на сорбенте силикагеле с использованием в качестве элюентов хлороформа, спиртоL40/100 хлороформных смесей в различных соотношениях, 95% спирта этилового.

Очистку веществ проводили рехроматографией на полиамиде (Woelm) и силикагеле L40/100 и перекристаллизацией. Выделенные в результате хроматографического разделения вещества были изучены с помощью УФ-, 1НЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии, различных химических превращений.

2.2.4.3. Высокоэффективная жидкостная хроматография ВЭЖХ-анализ проводили на жидкостном хроматографе Biotronic;

хроматографическая колонка Phenomenex Luna C18(2) (250 мм х 4,6 мм, 5 мкм), элюент А – ацетонитрил; элюент В - 0,01 М КН2РО4, подкисленный Н3РО4 до рН 3,00±0,01, расход подвижной фазы - 0,6 мл/мин, объем инжектируемой пробы 20 мкл. Режим элюирования – градиентный, двухступенчатый: элюент А 20% 9 мин;

подъем до 40% за 1 мин, 20 мин - 40% А. После фильтрования через слой алюминия оксида (х.ч., нейтральный II по Брокману) анализ проб проводили в изократическом режиме элюирования при 10% элюента А. Рабочая длина волны 280 нм была выбрана на основании спектра поглощения стандартного образца арбутина.

2.2.5. Спектральные методы (УФ-, ЯМР-спектроскопия, массспектрометрия) При изучении химического состава использовались УФ-, ЯМРспектроскопия, масс-спектрометрия, а также сочетание экстракционных методов и перекристаллизации.

Спектральные свойства выделенных веществ изучали с использованием следующих методов: ЯМР-спектры регистрировали на приборе «Varian-GeminiМГц) и «Bruker АМ 300» (300 МГц). Масс-спектры электронного удара регистрировали на масс-спектрометре «Kratos при энергии MS-30»

ионизирующих электронов 70 эВ и варьировании температуры ионного источника от 100 до 250 С. Определение температуры плавления выделенных веществ осуществляли на блоке Кофлера.

2.2.5.1. Электронная спектроскопия (ультрафиолетовая и видимая область спектра (180-700 нм)) Этот метод основан на регистрации электронных спектров поглощения, связанных с переходом валентных электронов с занятых орбиталей основного электронного состояния на вакантные орбитали возбужденного состояния.

Данный метод может быть использован для качественного и количественного анализа.

В исследовании регистрацию спектров проводили с помощью спектрофотометра «Specord 40» (Analytik Jena) в диапазоне длин волн 190-700 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм. С помощью данного метода были сняты кривые поглощения выделенных антоцианов.

С использованием данного метода разрабатывалась методика количественного определения антоцианов в свежих и воздушно-сухих плодах черники обыкновенной с использованием значения удельного показателя поглощения стандартного образца цианидина-3-О-глюкозида, а также методика определения суммы флавоноидов в побегах черники обыкновенной.

Результаты измерений обрабатывались с помощью программ WinASPECT и Microsoft Excel.

2.2.6. Технологические методы В исследовании использованы механические (отжим плодов, измельчение и смешение твердых материалов, просеивание, обработка материалов прессованием), гидромеханические (фильтрование, перемешивание в жидких средах), тепловые (нагрев, выпаривание) и массообменные (сушка, экстракция, растворение) процессы.

2.2.6.1. Получение сока из плодов черники обыкновенной Сок получали отжимом быстрозамороженных плодов черники обыкновенной после предварительной разморозки при комнатной температуре.

Полученный сок фильтровали через два слоя марли, оставляли в холодильнике при температуре 7±2 °С на 7 дней для отстаивания. Осадок отфильтровывали под вакуумом в колбу Бюнзена через воронку Бюхнера. В качестве фильтровального материала использовали фильтровальную бумагу («красная лента»). Для стабилизации использовали спирт этиловый и кислоту сорбиновую.

В связи с термолабильностью действующих веществ в плодах черники для сгущения исходного и стабилизированного сока рассматривались следующие варианты концентрирования под вакуумом:

в ротороно-вакуумном испарителе при 60±2 °С до 1/5-1/6 от первоначального объема; досушивание на водяной бане до остаточной влажности 18-22%;

в вакуум-сушильном шкафу при 40±2 °С при остаточном давлении не более 4,9 кПа до остаточной влажности 15-20%.

2.2.6.2. Таблетирование Таблетирование осуществляли на кривошипной таблеточной машине (рис.

7).

Рисунок 7 – Напольная кривошипная таблеточная машина салазочного типа.

В основном прессование осуществляли, минуя стадию гранулирования (прямое прессование). Прямое прессование позволяет исключить 3–4 технологические операции и, таким образом имеет преимущество перед таблетированием с предварительным гранулированием порошков [9].

2.2.6.3. Оценка показателей качества таблеток Контроль качества готовых таблеток проводился в соответствии с требованиями общей фармакопейной статьи «Таблетки» (ГФ СССР XI изд., вып.

2, с. 155-159) и ОФС 42-0003-04 «Растворение» по показателям:

- органолептические свойства;

- механическая прочность;

- распадаемость;

- растворение;

- средняя масса таблеток и отклонение в массе отдельных таблеток;

- содержание лекарственных веществ в таблетках.

Определение органолептических свойств, механической прочности, распадаемости и средней массы описаны в разделе, посвященной физическим методам.

Для определения количественного содержания антоцианов в таблетках 0,1 г (точная навеска) растертых таблеток (не менее 20 штук) помещали в коническую колбу вместимостью 100 мл, добавляли 20 мл 95% спирта, содержащего 1% хлористоводородной кислоты, перемешивали при комнатной температуре 20-25 мин, фильтровали через бумажный фильтр марки «красная лента» в мерную колбу емкостью 100 мл. Операцию повторяли трижды, последний раз нагревали на водяной бане 15 мин. Объем раствора доводили до метки 95% спиртом, содержащим 1% НСl. Полученный раствор спектрофотометрировали при длине волны 546 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм.

Тест «Растворение» проводили на аппарате «Вращающаяся корзинка» (рис.

9). Количество вещества, перешедшего в раствор определяли как среднее для 6 таблеток. Испытуемый образец помещали в сухую сетчатую корзинке цилиндрической формы с диаметром отверстий 0,25 мм. В качестве среды растворения использовали воду (500 мл). При испытании корзинка вращалась в среде для растворения со скоростью 100 об/мин. В процессе определения температура поддерживалась с помощью термостата на уровне 37±1 С.

–  –  –

2.2.6.4. Определение стабильности сиропа черники в процессе хранения Проводили долгосрочное испытание сиропа на стабильность (хранение в естественных условиях) на трех образцах сиропов [90]. Датой отсчета испытаний приняли дату завершения аналитического исследования сиропа по описанным выше методикам. Сироп хранили в прохладном, защищенном от света месте в наполненных доверху плотно укупоренных флаконах из темного стекла. Образцы хранили в закрывающемся шкафу, исключающем попадание прямых солнечных лучей, при относительной влажности воздуха не выше 70%. Влажность контролировали гигрометром психрометрическим типа ВИТ-1. Стабильность сиропа устанавливали через год по показателям: внешний вид, запах, вкус, плотность, показатель преломления, значение рН, количественное содержание суммы антоцианов.

2.2.7. Титриметрические методы В исследовании использовали фармакопейный метод определения дубильных веществ (метод Левенталя в модификации А.Л. Курсанова, перманганатометрический метод) в побегах и плодах черники обыкновенной [7].

2.2.8. Фармакологические методы Изучение диуретической активности проводили на белых беспородных крысах обоего пола массой 180-220 г. Животные содержались в виварии на обычном рационе при свободном доступе к воде. За день до опыта крысы получали внутрижелудочно водную нагрузку в объеме 3% от массы тела [24]. В день эксперимента животным контрольной группы при анализе водных извлечений вводилась водная нагрузка, при анализе водно-спиртовых извлечений

- спирт этиловый в концентрации, соответствующей анализируемым образцам и разведенный аналогичным образом; опытным группам при помощи внутрижелудочного зонда вводился лекарственный препарат в эквивалентном объеме [23]. Водные извлечения вводили в двух дозах (50 и 100 мг/кг), водноспиртовые в дозе 50 мг/кг. Всего было поставлено 20 серий экспериментов 10 опытных и 10 контрольных (по 10 животных в каждой серии).

Животные помещались в обменные клетки на 24 часа. По истечении 4 и 24 ч собранная моча анализировалась и подвергалась исследованию [24].

Определялась экскреция воды, регистрировалась концентрация натрия и калия методом пламенной фотометрии на ПАЖ-1, креатинина – колориметрическим методом на КФК-3. Статистическая обработка полученных результатов экспериментов проводилась с использованием стандартных методов вариационной статистики при помощи программ Microsoft Excel 2010 «Пакет анализа», Statistica 8.0 по критерию Манна-Уитни.

ГЛАВА 3. СРАВНИТЕЛЬНОЕ АНАТОМО-МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ

ИССЛЕДОВАНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ

ЧЕРНИКИ ОБЫКНОВЕННОЙ И БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ К НЕЙ ВИДОВ

В настоящее время в традиционной медицине используются значительное количество лекарственных растений [28, 36, 46]. При этом возникает проблема корректной диагностики лекарственного растительного сырья (ЛРС) морфологически сходных видов на этапе заготовительных мероприятий, при приемочном контроле сырья в цельном и особенно измельченном состоянии [62, 63]. В связи с широким внедрением в практику различных современных методов качественного и количественного анализа, а также усовершенствованием инструментального оснащения, возрастают возможности для идентификации ЛРС [62, 63]. Одним из путей решения данной проблемы является включение в нормативную документацию (фармакопейные статьи, фармакопейные статьи предприятий) морфолого-анатомического описания диагностических признаков сырья с применением цифровых микрофотографий [64].

Для черники обыкновенной фармакопейным сырьем являются плоды и побеги. Как уже отмечалось, исследование по морфолого-анатомическому исследованию плодов ранее на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии [17, 18, 19, 31]. Для побегов черники обыкновенной к морфологически сходным видам ЛРС, при идентификации которых могут возникнуть сложности, можно отнести листья брусники обыкновенной (Vaccinium vitis-idaea (L.) сем. Vacciniaceae), листья толокнянки (Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng., сем. Ericaceae). Морфологическое сходство объясняется близким родством указанных видов, входящих в порядок EricaIes Lindl. Подкласса Dilleniidae [81]. При заготовке данные виды растений могут выступать примесными по отношению друг к другу, поскольку они имеют общий ареал и местообитание [2, 11, 36].

Сравнительное морфологическое исследование побегов черники 3.1.

обыкновенной, брусники обыкновенной и толокнянки обыкновенной По своим морфологическим свойствам черника обыкновенная представляет собой многолетний полукустарник высотой 15-40 см с многочисленными зелеными остроребристыми веточками. Цветки одиночные, расположены при основании молодых веточек, поникающие, с кувшинчато-шаровидным зеленовато-розовам венчиком. Плод – черная ягода с сизым налетом, шарообразная, приплюснутая или несколько удлиненная, диаметром 6-8 мм, с блюдцевидным широким вдавлением на верхушке – диском. Семена многочисленные (рис. 10А) [48, 55, 66].

Брусника обыкновенная – вечнозеленый прямостоячий полукустарничек 5см высотой, с ползучим длинным корневищем и ветвистым стеблем. Молодые ветви зеленые, слабо короткоопушенные. Цветки собраны на концах прошлогодних ветвей в плотные поникшие кисти по 3-8, венчик колокольчатый, бледно-розовый или почти белый. Плод – шаровидная или слегка приплюснутая 4-гнездная ягода. Семена многочисленные (рис. 10Б) [48, 55].

Толокнянка обыкновенная – вечнозеленый, стелющийся, длиной 30-130 см, сильноветвящийся кустарничек с красно-бурой корой. Молодые ветви зеленые, мелко опушенные. Цветки расположены на концах ветвей в коротких поникающих кистях. Венчик розовый, кувшинчатый, с 5-зубчатым отгибом. Плод

– слегка приплюснутая костянка, красная с легкой желтизной, ягодообразная, 6-8 мм диаметром. Полноценных семян в плоде 1-2 (рис. 10В) [48, 55].

Рисунок 10 – Гербарные образцы исследуемых растений (гербарный фонд кафедры фармакогнозии СамГМУ, образцы 2012 года, собранные в Республике Марий Эл): А – черники обыкновенная; Б – брусника обыкновенная; В – толокнянка обыкновенная.

Анализ внешних признаков лекарственного растительного сырья исследуемых видов показал, что все образцы соответствуют требованиям Государственной Фармакопеи СССР XI издания и частных фармакопейных статей [8, 82]. Результат сравнения основных диагностических признаков листьев (рис.

11), изучаемых объектов приведен в таблице 2.

Рисунок 11 – Морфологические признаки листьев исследуемых видов: А – верхний эпидермис; Б – нижний эпидермис. Обозначения: 1 - черники обыкновенная; 2 – брусника обыкновенная; 3 – толокнянка обыкновенная.

–  –  –

По результатам сравнительного морфологического анализа исследуемых видом можно сказать, что есть небольшие различия в форме края листовой пластинки, цвете верхнего и нижнего эпидермиса, длине черешка и структуре.

Однако эти различия незначительны и не могут быть использованы для однозначной диагностики ЛРС, особенно если оно в измельченном состоянии. В связи с этим необходимы дополнительные анатомо-гистологические исследования сырья черники обыкновенной, брусники обыкновенной и толокнянки обыкновенной.

Сравнительное анатомо-гистологическое исследование побегов 3.2.

черники обыкновенной, брусники обыкновенной и толокнянки обыкновенной Анатомо-гистологическое исследование изучаемых видов лекарственного растительного сырья проводили в соответствии с требованиями общей фармакопейной статьи «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» и требованиями частных фармакопейных статей [7].

При рассмотрении, сравниваемых листьев с поверхности, видны клетки эпидермиса. У толокнянки клетки верхнего и нижнего эпидермиса преимущественно изодиаметрической формы с прямыми утолщенными стенками, полигональные, мелкие (длиной 29-46 мкм, шириной 22-36 мкм); у брусники клетки верхнего эпидермиса слабоизогнутые длиной 21-50 мкм, шириной 21-35 мкм, клетки нижнего эпидермиса слабоизвилистые длиной 10-50 мкм, шириной 8мкм; у черники клетки эпидермиса с верхней и нижней стороны с извилистыми тонкими стенками длиной 31-80 мкм, шириной 20-65 мкм (рис. 12-13).

Устьица у всех изучаемых видов расположены на нижнем эпидермисе (гипостоматический тип). У черники устьица вытянутой колпачковидной [64] формы, длиной 21-30 мкм, шириной 15-20 мкм, окружены 4-6 околоустьичными клетками (анамоцитного типа). У толокнянки устьица присутствуют только на нижнем эпидермисе, они чечевицевидные [64], длиной 35-45 мкм, шириной 41-50 мкм, с узкой устьичной щелью, широким передним двориком (преддверьем, криптой), отграниченным от внешней среды кутикулярным сводом, имеющим в центре отверстие; околоустьичных клеток 6-9 (анамоцитного типа). У брусники устьица многочисленные, мелкие, сферовидной [64] формы, длиной 18-30 мкм, шириной 10-15 мкм, окружены 4 околоустьичными клетками. Встречаются клетки с бурым содержимым (рис. 13).

Необходимо отметить, что форма устьичных клеток весьма характерна для сравниваемых видов и является весомым признаком в их диагностики.

Рисунок 12 – Сравнение верхнего эпидермиса листовой пластинки исследуемых видов: А – черника обыкновенная; Б – брусника обыкновенная; В – толокнянка обыкновенная. Обозначения: 1 – клетки эпидермиса; 2 – клеточная стенка.

Рисунок 13 – Сравнение нижнего эпидермиса листовой пластинки исследуемых видов: А – черника обыкновенная; Б – толокнянка обыкновенная; В – брусника обыкновенная. Обозначения: 1 – клетки эпидермиса; 2 – клеточная стенка; 3 – устьица; 4 – околоустьичные клетки.

У черники обыкновенной по жилкам с верхней стороны расположены одноклеточные, толстостенные прямые волоски с грубой бородавчатой поверхностью длиной 23-52 мкм. На обеих сторонах листа (по жилкам и на краевых зубцах) встречаются булавовидные железки длиной 150-200 мкм с многоклеточной двурядной ножкой и многоклеточной головкой с бурым содержимым (длина головки 60-80 мкм, ширина 50-65 мкм).

Рисунок 14 – Трихомы черники обыкновенной: А – булавовидная железка; Б – прямые волоски. Обозначения: 1 – клетки эпидермиса; 2 – волоски; 3 – ножка железки; 4 – головка железки; 5 - устьице.

Лист брусники обыкновенной аналогично чернике на нижней стороне имеет булавовидные железки с бурым содержимым, длиной 160-240 мкм, высота головки 105-130 мкм, ширина 65-100 мкм (рис. 15А, Б). По жилкам и на черешке листа брусники встречаются одноклеточные волоски с толстыми стенками и гладкой или слабобородавчатой поверхностью длиной 100-140 мкм (рис. 15В).

А Б В Рисунок 15 – Трихомы брусники обыкновенной: А – Эпидермис. Железки (х40); Б

– Эпидермис. Железки (х100); В – Поперечный срез черешка. Волоски. Окраска суберином (х40). Обозначения: 1 – булавовидная железка; 2 – жилка; 3 – клетки эпидермиса.

Листовая пластинка толокнянки не опушена. Однако на эпидермисе черешка листа толокнянки, особенно с верхней стороны, расположены простые и головчатые волоски. Простые волоски длинные 1-2-клеточые, длинные, изогнутые. Головчатые волоски (длиной 25-40 мкм) на 1-2 клеточной ножке с многоклеточной головкой с содержимым коричневого цвета.

Рисунок 16 – Трихомы толокнянки обыкновенной: А – увеличение х 40; Б – увеличение х 100. Обозначения: 1 – головчатые волоски; 2 – простые волоски.

Особенность опушения сравниваемых листьев является скорее общим признаком для представителей семейства Vacciniaceae и Ericaceae и не достаточным для диагностики подлинности.

При рассмотрении с поверхности у черники обыкновенной вдоль жилок с нижней стороны листа выражена кристаллоносная обкладка (рис. 17). У толокнянки крупные жилки сопровождаются кристаллами оксалата кальция в виде призм, кристаллов и друз. У брусники в мезофилле встречаются редкие одиночные призматические кристаллы оксалата кальция и друзы, более часто ближе к жилкам и в черешках.

Рисунок 17 – Кристаллы исследуемых видов: А – черника обыкновенная; Б – толокнянка обыкновенная; В – брусника обыкновенная. Обозначения: 1 – жилка, 2 – кристаллы оксалата кальция, 3 – клетки эпидермиса; 4 – устьице; 5 – клетки мезофилла, 6 – межклетники.

При анализе поперечных срезов листовых пластинок выявлено, что у всех сравниваемых видов они имеют дорсовентральное строение. Толщина листовой пластинки у черники обыкновенной в области главной жилки достигает 230-290 мкм, по бокам от главной жилки 110-140 мкм; у толокнянки обыкновенной – 200мкм и 210-250 мкм соответственно и у брусники – 300-360 мкм и в области главной жилки и по бокам от нее.

У черники обыкновенной адаксиальная сторона главной жилки уплощена или вдавлена, абаксиальная – сильно выпуклая, округлой формы (рис. 18А).

Кристаллы содержатся в клетках с тонкими оболочками (рис. 17А). Край листа не имеет механических элементов. На крупных жилках кутикула с обеих сторон листа имеет хорошо различимые складки; местами складчатость кутикулы встречается и между жилками.

Верхний эпидермис листа черники подстилается одним рядом довольно рыхлых палисадных клеток (рис. 18А), высота которых сильно варьирует (20-48 мкм). Губчатая паренхима очень рыхлая, с лопастными клетками. Жилки имеют тяжи волокон, сопровождающие проводящие пучки. В главной жилке кроме волокон, может быть развита с обеих сторон колленхима (рис. 18А, 19А).

При анатомическом исследовании поперечного среза листа толокнянки обыкновенной видно, что палисадная паренхима образует несколько неправильных рядов. Она представлена клетками неправильной формы и занимает до половины толщины листа. Губчатая паренхима очень рыхлая с крупными воздухоносными полостями, клетки нелопастные, но чаще неправильной формы (рис. 18Б). Наружная стенка эпидермальных клеток сильно утолщена и кутинизирована (рис. 18Б). Сверху и снизу крупных жилок непосредственно под эпидермисом располагается уголковая колленхима. По краю листа также тянется колленхима, занимающая субэпидермальное положение (рис.

18Б, 19Б). Вдоль жилок встречаются кристаллы оксалата кальция (рис. 18Б, 19Б).

У брусники под верхним эпидермисом располагается несколько неправильных рядов палисадной паренхимы (толщина 75-120 мкм), занимающей менее половины толщи пластинки (рис. 18В). Губчатая паренхима очень рыхлая с крупными воздухоносными полостями (рис. 18В). Наружная стенка клеток сильно кутинизирована. Сверху и снизу от проводящего пучка хорошо развиты тяжи волокон. По краю листа также наблюдается уголковая колленхима. В мезофилле встречаются редкие одиночные кристаллы и друзы оксалата кальция (рис. 18В).

Рисунок 18 - Поперечные срезы листа исследуемых видов растений (х100): А – черника обыкновенная; Б – толокнянка обыкновенная; В – брусника обыкновенная. Обозначения: 1 – колленхима; 2 – механическая ткань; 3 – проводящий пучок; 4 – кутикула; 5 – нижний эпидермис; 6 – толстостенный волосок; 7 – верхний эпидермис; 8 – столбчатая паренхима; 9 – губчатая паренхима; 10 - флоэма; 11 – проводящий пучок не главной жилки.

Рисунок 19 - Поперечные срезы листа исследуемых видов растений (х400): А – черника обыкновенная; Б – толокнянка обыкновенная; В – брусника обыкновенная. Обозначения: 1 – кристаллы оксалата кальция; 2 – тяжи волокон;

3 – проводящий пучок; 4 – кутикула; 5 – нижний эпидермис; 6 – колленхима; 7 – верхний эпидермис; 8 – столбчатая паренхима; 9 – губчатая паренхима; 10 древесина; 11 – флоэма.

Так как лекарственным растительным сырьем черники обыкновенной являются побеги нами было проведено сравнительное анатомогистологическое исследование стеблей исследуемых видов с целью подтверждения диагностики и предупреждения возможной фальсификации.

Стебли черники обыкновенной на поперечном срезе имеет характерную неправильно угловатую форму с четырьмя сильно зауженными рёбрами часто расположенными под острым углом к основной поверхности стебля (рис.20А).

Описанное очертание стебля в значительной степени отличает чернику от сравниваемых видов толокнянки и брусники у которых очертание поперечных срезов стеблей округлое (рис. 20). Стебли всех сравниваемых видов непучкового строения.

Рисунок 20 – Поперечные срезы стеблей: А – черники обыкновенной; Б – толокнянки обыкновенной; В – брусники обыкновенной. Обозначения: 1 – эпидермис, 2 – первичная кора, 3 - флоэма; 4 – древесина; 5 – сердцевина.

Эпидермис стебля черники обыкновенной с поверхности представлен клетками различной формы с прямыми боковыми стенками, густо пронизанными порами. Устьица многочисленные, окружены четырьмя околоустьичными клетками. Причем 2 клетки расположены параллельно устьичной щели, а две другие перпендикулярно ей (рис. 21).

Рисунок 21 – Эпидермис стебля черники (х400). Обозначения: 1 – клетки эпидермиса;2 – околоустьичные клетки;3 – замыкающие клетки устьиц.

Под эпидермисом расположена основная хлорофиллоносная паренхима первичной коры, представленная несколькими рядами клеток овальной формы с относительно утолщенными целлюлозными оболочками (рис. 22А). Ниже расположена рыхлая паренхима с крупными межклетниками, значительно превышающими размеры клеток. В клетках паренхимы встречаются включения в виде кристаллов различной формы и размера, а также друз (рис. 22).

Центральный цилиндр занимает основную часть стебля. Флоэма выражена слабо. С периферии она армирована склеренхимными волокнами, расположенными небольшими группами, перемежающимися с клетками основной паренхимы (рис. 22Б). Волокна склеренхимы на поперечном сечении мелкие, округлой формы с лигнифицированными стенками. Полости волокон щелевидные. Проводящие элементы флоэмы расположены непрерывным кольцом и представлены мелкими тонкосненными клетками с темно-бурым содержимым, выделяющим флоэмную область. Клетки флоэмы неправильной угловатой формы (рис. 22Б).

Древесина стебля черники представлена мелкими сосудами четкими однорядными сердцевинными лучами; некрупными рассеянными сосудами и толстостенными клетками основной ткани в радиальных рядах. Сердцевина слагается из толстостенных пористых клеток (рис. 23).

Рисунок 22 – Первичная кора стебля черники обыкновенной (х400): А – Эпидермис и субэпидермальные слои; Б – Флоэма, камбий и древесина.

Обозначения: 1 – кутикула; 2 – эпидермис; 3 – основная хлорофиллоносная паренхима; 4 – флоэма; 5 – кольцо механической ткани; 6 – древесина.

Рисунок 23 – Древесина и сердцевина стебля черники обыкновенной (х400): А – до обработки раствором щелочи; Б – после обработки. Обозначения: 1 – ;2 – клетки сердцевины;3 – древесина.

Побег толокнянки на поперечном сечении имеет почти правильную, округлую форму (рис. 20Б). Эпидермис на поперечном сечении представлен клетками овальной или прямоугольной формы с утолщенной наружной стенкой, покрытой значительным слоем кутикулы (рис. 24). Эпидермис, при рассмотрении с поверхности представлен почти правильными рядами клеток прямоугольной формы с утолщенными оболочками. Особенно утолщенны оболочки, параллельные оси побега. На эпидерме имеются простые одноклеточные волоски длиной 120-160 мкм (рис. 25). Устьица анамоцитного типа встречаются редко.

Под эпидермой расположена слабо выраженная колленхима в один слой клеток (рис. 24). Первичная кора представлена клетками овальной формы с заметно утолщенными целлюлозными стенками, насчитывающими до 10-ти рядов. Размеры клеток составляют от 18 до 46 мкм в длину и от 15 до 40 мкм шириной. Встречаются клетки, содержащие призматические кристаллы оксалата кальция (рис. 24).

Флоэмная часть центрального цилиндра, аналогично побегам черники, выражена слабо. Склеренхимные волокна разрозненные, собранные в небольшие группы с периферии флоэмы (рис. 24). На поперечном сечении склеренхимные волокна имеют 4-х 5-ти угольную форму с заметными полостями (рис. 24Б).

Проводящие элементы флоэмы цитологически схожи с таковыми у побегов черники (рис. 24Б). Флоэмная область также исходно окрашена в темно-бурый цвет (рис. 24Б).

Древесина побегов толокнянки кольцесосудистого типа. Сердцевидные лучи ксилемы обычно однорядные; сосуды мелкие (рис. 24). Сердцевина слагается из толстостенных пористых клеток овальной или округлой формы диаметром от 10 до 50 мкм (рис. 24А).

Рисунок 24 – Поперечный срез стебля толокнянки обыкновенной: А – увеличение х100; Б – увеличение х 400. Обозначения: 1 – кутикула; 2 – эпидермис; 3 – коровая часть; 4 – лубяные волокна; 5 – элементы флоэмы; 6 – древесина.

Рисунок 25 – Эпидермис стебля толокнянки обыкновенной. Волоски.

Побег брусники анатомически сходен с побегом толокнянки (рис. 20).

Однако у брусники менее выражена первичная кора относительно центрального цилиндра.

Эпидермис на поперечном сечении также имеет прямоугольную форму сильно сдавленную с поверхности. Наружная оболочка значительно утолщена и покрыта толстым слоем кутикулы (рис. 26Б). С поверхности клетки эпидермиса угловатые почти прямоугольной формы. Эпидермис густо опушен. Трихомы представлены простыми одноклеточными волосками длиной до 150-200 мкм (рис.

28). Под эпидермисом расположена уголково-пластинчатая колленхима, достигающая 2-3 слоя клеток. За колленхимой следует основная паренхима первичной коры (5-7 слоев клеток). Паренхима первичной коры составлена из крупных клеток (длиной 50-72 мкм, шириной 10-21 мкм), овальной иногда сильно вытянутой в тангентальном направлении формы (рис.26). Протопласт в клетках аморфный, окрашенный в бурый цвет. В клетках паренхимы встречаются призматические кристаллы оксалата кальция (рис. 26Б).

Флоэмная часть по цитологической характеристике схода со сравниваемыми видами. Однако лубяные волокна имеют более узкий просвет по сравнению с побегами толокнянки обыкновенной и сгруппированы в более крупные группы, расположенные равномерно перемежаясь с клетками основной паренхимы (рис. 26, 27). Флоэма аналогично сравниваемым видам, пигментирована в бурый цвет (рис. 26Б, 27А).

Древесина побегов брусники рассеянососудистого типа. Сердцевинные лучи обычно однорядные, сосуды некрупные. Сердцевина представлена округлыми или овальными клетками с толстыми пористыми стенками диаметром от 10 до 40 мкм (рис. 27Б). Клеточные стенки лигнифицированы. Полости клеток заполнены аморфным протопластом серого цвета. В паренхиме сердцевины отчетливо видны мелкие межклетники округлой формы (рис. 27Б).

Рисунок 26 – Поперечный срез стебля брусники обыкновенной: А – увеличение х100; Б – увеличение х400, первичная кора. Обозначения: 1 – кутикула; 2 – эпидермис; 3 – колленхима; 4 – основная паренхима; 5 – лубяные волокна; 6 – пигментированные клетки флоэмы; 7 – древесина; 8 – сердцевина; 9 – простые волоски; 10 – кристаллы оксалата кальция.

Рисунок 27 – Поперечный срез стебля брусники обыкновенной: А – камбиальная зона; Б – сердцевина. Обозначения: 1 – кутикула; 2 – эпидермис; 3 – колленхима; 4 – основная паренхима; 5 – лубяные волокна; 6 – кольцо механической ткани; 7 – сердцевинные лучи; 8 – волокна; 9 – клетки сердцевины.

Рисунок 28 – Эпидермис стебля толокнянки обыкновенной. Волоски.

Таким образом, проведено сравнительное исследование листьев и стеблей черники обыкновенной, брусники обыкновенной, толокнянки обыкновенной, позволяющие проводить диагностику данных растений. Однако для более детального исследования, особенно в связи с тем, что диагностические признаки листовых пластинок двудольных растений особенно близкородственных часто схожи, возникает необходимость дополнительных селективных данных анатомогистологии для более точной диагностики сырья [69]. К таким признакам можно отнести строение черешков листьев исследуемых растений.

Сравнительное исследование петиолярных признаков черники 3.3.

обыкновенной, брусники обыкновенной и толокнянки обыкновенной В последнее время получает распространение петиолярная анатомия как метод более селективной диагностики лекарственного растительного сырья [32, 33, 34, 35, 41, 54, 69], нами было изучены морфолого-анатомические особенности строения черешков исследуемых видов растений.

Известно, что особенности строения черешка на его протяжении могут меняться [69], однако в связи с небольшими размерами черешков исследуемых видов, особенно для черники и брусники, нами были изучены медиальные части черешков, наиболее характеризующие их анатомические особенности.

Проведенный анализ показал, что черешки толокнянки, брусники и черники имеют на поперечном сечении полулунное очертание (рис. 29), что, очевидно является общим признаком для представителей, изучаемых семейств.

Отличительной чертой черники обыкновенной является наличие в очертании поперечного сечения острых выдающихся бортов черешка. У сравниваемых видов борта черешков тупые, округлой формы (рис. 29).

В центре сравниваемых черешков у всех, анализируемых объектов расположен всего один закрытый коллатеральный проводящий пучок (рис. 29).

Рисунок 29 – Сравнение поперечных сечений черешков листьев: А - брусника обыкновенная, Б - черника обыкновенная; В - толокнянка обыкновенная.

Эпидермис черешков листьев исследуемых видов, при рассмотрении на поперечном сечении, представлен мелкими, кутинизированными клетками чаще прямоугольной, реже округлой формы (рис. 30).

Топография колленхимы примерно одинакова. Тип колленхимы – уголковый у всех сравниваемых видов. Колленхима располагается непосредственно под эпидермисом в несколько слоев по всему периметру среза.

Однако имеются отличительные особенности по выраженности колленхимного слоя и характеру клеток. У черешков толокнянки колленхимные клетки крупнее, чем у сравниваемых видов и слой колленхимы в отдельных случаях может достигать до 5-ти рядов клеток. Колленхимные клетки округлой или овальной формы, их размер увеличивается в глубину черешка (рис. 30Б). Колленхима черешков черники и брусники выражена слабо и представленная мелкими клетками с пигментированными целлюлозными стенками (рис. 30А, В). У черники и брусники колленхима неоднородна. У обоих видов колленхима также представлена по всему периметру, однако образует более крупные участки в ребрах, которые у черники имеют более угловатую форму (рис. 29А,Б, 30 А,В).

Колленхима в абаксиальной и адаксиальной части черешков исследуемых видов отличается по степени утолщенности и выраженности (рис. 30 А,В, 31А,В). У черешков листьев черники и брусники утолщенность клеток и количество слоев составляющих ее клеток больше в адаксиальной части по сравнению с абаксиальной (рис. 29А,Б). В адаксиальной части она более уплотнена, клетки имеют прямоугольную форму, в абаксиальной части они относительно округлые (уголковый тип). Количество слоев колленхимы в абаксиальной части у брусники достигает 4-5, у черники колленхима представлена 1-3 слоем.

Основная паренхима черешков также отличается. У черешков толокнянки она представлена овальными клетками с утолщенными оболочками и рыхлым протопластом серого цвета. В паренхиме имеются межклетники. Размеры клеток при приближении к пучку увеличиваются, достигая до 40 мкм в длину (рис. 29В, 30Б).

Основная паренхима у черешков черники и брусники выражена, представлена тонкостенными клетками от 10 до 80 мкм в диаметре. Имеются крупные клетки (идиобласты), содержащие призматические кристаллы и друзы оксалата кальция. Крупные идиобласты особенно характерны для основной паренхимы черешков брусники. Межклетники отсутствуют (рис. 30А,В, 31 А,В, 32А,В).

Склеренхима у всех исследуемых видов расположена во флоэмной части коллатеральных пучков. Пучки всех трех видов имеют в очертании полулунную форму и расположены в центральной части черешка или несколько ближе к брюшной (абаксиальной) части (рис. 33). У черники и брусники пучки армируются первичной склеренхимой со стороны флоэмы (рис. 33А,В). Также, в отличие от черешка листа толокнянки, флоэмная часть пучков пигментирована (рис. 33А, В).

Отличительной особенностью черешков также является особенность их опушение. У толокнянки обыкновенной с верхней стороны черешка и у основания листа встречаются простые и головчатые волоски (рис. 16). У черники трихомы (одноклеточные, кутинизированные толстостенные прямые волоски с грубой бородавчатой поверхностью длиной 23-52 мкм) представлены на бортах черешка и с адаксиальной стороны. У брусники трихомы (одноклеточные волоски с толстыми кутинизированными стенками и гладкой или слабобородавчатой поверхностью длиной 100-140 мкм) представлены по всей поверхности, однако максимальная опушенность с адаксиальной стороны (рис. 15В, 34).

У толокнянки также максимальная опушенность с адаксиальной стороны и представлена головчатыми волосками (длиной 25-40 мкм) с многоклеточной головкой с содержимым коричневого цвета и простыми волосками (рис. 16).

Рисунок 30 – Борта черешков (поперечный срез): А – черника обыкновенная; Б – толокнянка обыкновенная; В – брусника обыкновенная. Обозначения: 1 – кутикула; 2 – эпидермис; 3 – колленхима; 4 – паренхима; 5 – друзы оксалата кальция; 6 – волоски.

Рисунок 31 – Абаксиальная сторона черешков: А – черника обыкновенная; Б – толокнянка обыкновенная; В – брусника обыкновенная.

Рисунок 32 – Адаксиальная сторона черешков: А – черника обыкновенная; Б – толокнянка обыкновенная; В – брусника обыкновенная. Обозначения: 1 – ксилема; 2 – друзы оксалата кальция; 3 – паренхима; 4 – эпидермис; 5 – колленхима; 6 – межклетники, 7 - волоски.

Рисунок 33 – Черешки. Окраска сернокислым анилином: А – черника обыкновенная; Б – толокнянка обыкновенная; В – брусника обыкновенная.

Рисунок 34 – Поперечные срезы черешков. Окраска суданом III: А – черника обыкновенная; Б - брусника обыкновенная.

–  –  –

Таким образом, можно сказать, что диагностическое значение при морфолого-анатомическом исследовании лекарственного растительного сырья побегов черники обыкновенной, листьев толокнянки обыкновенной и брусники обыкновенной имеют:

1. Морфологические особенности (форма, жесткость листовой пластинки).

Однако этих признаков не всегда бывают достаточны, особенно при анализе измельченного сырья.

2. Строение эпидермиса (извилистость стенок, устьичный аппарат, характер опушенности, типы трихом).

3. Особенности петиолярной анатомии.

4. Строение первичной коры стебля исследуемых видов.

Выводы к главе 3 В результате проведенного сравнительных морфолого-анатомических исследований плодов и побегов черники обыкновенной, в том числе в сравнении с побегами брусники обыкновенной и толокнянки обыкновенной, нами были сделаны следующие выводы:

1. Впервые проведено сравнительное морфолого-анатомическое исследование побегов черники обыкновенной, брусники обыкновенной и толокнянки обыкновенной; подтверждены имеющиеся литературные данные об особенностях строения исследуемых видов ЛРС.

2. Впервые изучены петиолярные признаки листьев черники обыкновенной и двух потенциально примесных видов - брусники обыкновенной и толокнянки обыкновенной.

3. Определены основные анатомо-гистологические особенности листьев черники обыкновенной в сравнении с другими видами:

- трихомы (форма, размеры, локализация),

- форма клеток эпидермиса листовой пластинки,

- наличие выраженной кристаллоносной обкладки;

- соотношение размеров главной жилки по отношению к толщине остальной листовой пластинки;,

- соотношение губчатой и столбчатой паренхимы;

- особенности строения черешка:

Форма поперечного сечения: полулунная форма, слегка сплюснутая с адаксиальной стороны;

В паренхиме черешка локализован один закрытый коллатеральный пучок (центральная жилка), расположенный по центру, ближе к адаксиальной стороне. Пучок армирован с обеих сторон, склеренхима мощная.

Колленхима представлена по всему периметру, неоднородна;

образует более крупные участки в ребрах, более угловатых, чем у других видов, более выражена в адаксиальной части по сравнению с абаксиальной. Количество слоев в абаксиальной части – 1-3.

Основная паренхима представлена тонкостенными клетками от 10 до 80 мкм в диаметре. Имеются крупные клетки (идиобласты), содержащие призматические кристаллы и друзы оксалата кальция Эпидермис опушен с адаксиальной стороны простыми одноклеточными волосками с грубой бородчатой поверхностью длиной 23-52 мкм.

4. Определены основные анатомо-гистологические особенности стеблей черники обыкновенной в сравнительном плане с другими близкородственными видами (толокнянкой и брусникой):

- форма поперечного сечения стебля,

- строение первичной коры;

- особенности строения древесины и клеток сердцевины.

5. Полученные сравнительные данные могут быть использованы при доработке раздела «Микроскопия» имеющихся ФС на ЛРС «Черники обыкновенной побеги», «Брусники листья», «Толокнянки листья» с целью усовершенствования существующих методик стандартизации.

ГЛАВА 4. ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЧЕРНИКИ

ОБЫКНОВЕННОЙ

Сравнительное исследование химического состава плодов и побегов 4.1.

черники обыкновенной На предварительном этапе нами было проведено сравнительное исследование химического состава свежих и воздушно-сухих плодов и побегов черники обыкновенной методом ТСХ и спектрофотометрии. Также были разработаны методики качественного анализа схожих видов лекарственного растительного сырья, имеющих аналогичный ареал: побегов черники обыкновенной, листьев толокнянки обыкновенной [Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng.) и брусники обыкновенной (Vaccinium vitis-idaea L.]. Проведено сравнительное изучение антоцианового состава плодов черники обыкновенной, плодов черной смородины (Ribes nigrum L.) и плодов аронии черноплодной [Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott].

Хроматографическое исследование полученных извлечений показало, что лучшее разделение комплекса соединений на используемых хроматографических пластинках обеспечивают системы н-бутанол – уксусная кислота – вода (4:1:2) и хлороформ – метанол - вода (26:14:3). Для анализа антоцианов более приемлемой является система с уксусной кислотой, в которой происходит видимое разделение окрашенных в характерные для антоцианов цвета пятен. Антоцианы в УФ-свете флуоресцируют слабо.

При сравнительном исследовании химического состава свежих и воздушносухих плодов черники пробоподготовку осуществляли следующим образом: 2,0 г плодов помещали в коническую колбу со шлифом, добавляли 10 мл 95% спирта этилового, содержащего 1% хлороводородной кислоты, закрывали пробкой и перемешивали в течение 30 мин. Извлечение фильтровали через бумажный фильтр «красная полоса» и 0,02 мл полученного извлечения наносили на линию старта пластинки «Сорбфил-ПТСХ-АФ-А-УФ», проведенную на расстоянии 1,5 см от нижнего края. Пластинку высушивали на воздухе и хроматографировали восходящим способом в системе н-бутанол – ледяная уксусная кислота – вода (4:1:2). На хроматограмме свежих плодов обнаруживаются 3 доминирующих антоциана, в то время как воздушно-сухие плоды имеют некоторые различия в профиле антоцианов, что подтверждает литературные данные о лабильности антоцианов и их значительной потере при сушке. Общим для извлечений из свежих и воздушно-сухих плодов можно считать наличие цианидин-3-Оглюкозида (Rf ~ 0,36) и мальвидин-3-О-глюкозида (Rf ~ 0,51) (рис. 35).

Рисунок 35 – ТСХ–анализ: система н-бутанол - ледяная уксусная кислота вода (4:1:2). Обозначения: 1 – спиртовое извлечение из воздушно-сухих плодов черники; 2 – спиртовое извлечение из плодов черники свежих; 3 - мальвидин-3-Оглюкозид; 4 - цианидин-3-О-глюкозид; 5 - дельфинидин-3-О-глюкозид По результатам хроматографического исследования в системе н-бутанол – ледяная уксусная кислота – вода (4:1:2) также видно, что антоциановый состав плодов черники обыкновенной по сравнению с другими также широко употребляемыми темноокрашенными плодами отличается, вследствие чего данный метод может быть использован для оценки подлинности данных видов ЛРС. Во всех плодах имеется цианидин-3-О-глюкозид (наиболее распространенный антоциан в растительном мире). Диагностическим признаком плодов черники обыкновенной является наличие пятна, соответствующего мальвидин-3-О-глюкозиду (Rf ~ 0,51) (рис. 36).

Рисунок 36 - Сравнительный ТСХ - анализ антоцианов плодов изучаемых растений. Обозначения: 1 – плоды аронии черноплодной; 2 – плоды черники обыкновенной; 3 – плоды черной смородины.

Также различия наблюдаются в электронных спектрах поглощения извлечений из плодов. Извлечение из свежих плодов черники имеет максимумы поглощения при 282±2 нм и 545±2 нм, соотношение (А282/А546) примерно составляет 1,0:1,5, что близко к спектральным характеристикам цианидин-3-Оглюкозида. Для воздушно-сухих плодов это соотношение изменяется в пользу коротковолнового максимума и составляет 1,0:0,100,15 (рис. 37).

Рисунок 37 – Спектры поглощения водно-спиртового извлечения: 1 - из свежих плодов черники обыкновенной, 2 - воздушно-сухих плодов черники обыкновенной; 3

- цианидин-3-О-глюкозида в 95% этиловом спирте, содержащем 1% НСl.

В спектре поглощения из плодов аронии черноплодной имеются максимумы поглощения при 282±2 нм и 537±2 нм, имеется плечо при 324±2 нм. В спектре плодов черной смородины максимумы поглощения при 272±2 нм и при 541±2 нм (рис. 38).

Интенсивность поглощения извлечений из плодов увеличивается в кислой среде, практически достигая значений оптической плотности при 280-290 нм, но длина волны максимума практически не смещается. Этот факт связан с известным переходом антоцианов в кислой среде в форму флавилиевого катиона с максимумом поглощения в видимой области.

При добавлении раствора алюминия хлорида наблюдается батохромный сдвиг.

А Б В Рисунок 38 – Спектры поглощения антоцианов плодов: А – плодов черники обыкновенной; Б – плодов черной смородины; В – плодов аронии черноплодной.

Обозначения: 1 – исходный раствор; 2 – в кислой среде; 3 – после добавления алюминия оксида.

С целью проведения сравнительного исследования побегов черники, листьев брусники и листьев толокнянки получали извлечение из них с использованием водно-спиртовых смесей с различной концентрацией спирта этилового. Анализируемые образцы представлены в таблице 4.

–  –  –

В процессе пробоподготовки 0,50 г измельченного лекарственного растительного сырья помещали в колбу, добавляли 10 мл соответствующего экстрагента и нагревали с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 15 мин. Полученное извлечение охлаждали и фильтровали через бумажный фильтр (марки «красная полоса»).

Разделение проводили в подвижных системах: хлороформ –спирт этиловый 96%– вода (26:16:3) и н-бутанол – ледяная уксусная кислота – вода (4:1:2).

Хроматографические пластины после элюирования просматривали в видимом свете, при воздействии УФ-света с длинами волн 254 и 366 нм и обрабатывали раствором диазобензолсульфокислоты в насыщенном растворе натрия карбоната.

Оптимальное разделение наблюдалось в системе н-бутанол – ледяная уксусная кислота – вода (4:1:2).

При просмотре при дневном свете для хроматограммы извлечения из листьев толокнянки была характерна интенсивная темноокрашенная полоса до значения Rf 0,55 (рис. 39).

При просмотре под лампой с УФ-излучением 254 нм (рис. 40) для водноспиртовых извлечений из исследуемых образцов побегов черники обыкновенной были характерны пятна со значениями Rf 0,41–0,42 и Rf 0,15–0,16; для извлечений из листьев брусники обыкновенной – пятна со значениями Rf 0,65– 0,66, Rf 0,58–0,59 и Rf 0,15–0,16; для извлечений из листьев толокнянки обыкновенной – пятно со значением Rf 0,57–0,58.

После обработки раствором диазобензолсульфокислоты эти же пятна окрашивались в различные цвета от желтого до темно-коричневого. В побегах черники дополнительно проявлялось пятно со значением Rf 0,19–0,20, а в толокнянке – пятно со значением Rf 0,63–0,64 (рис 41).

По предварительным оценкам, наибольшей экстракционной способностью обладают водно-спиртовые смеси с концентрацией спирта этилового 70% и 40%.

Рисунок 39 – Схема хроматографического разделения веществ побегов черники обыкновенной, листьев толокнянки обыкновенной и брусники обыкновенной в системе н-бутанол – ледяная уксусная кислота – вода (4:1:2 об/об/об) в присутствии РСО арбутина при просмотре в дневном свете. Обозначения: в соответствии с таблицей 4.

Рисунок 40 – Схема хроматографического разделения веществ побегов черники обыкновенной, листьев толокнянки обыкновенной и брусники обыкновенной в системе н-бутанол – ледяная уксусная кислота – вода (4:1:2 об/об/об) в присутствии РСО арбутина (УФ-254 нм). Обозначения: в соответствии с таблицей 4.

Рисунок 41 – Схема хроматографического разделения веществ побегов черники обыкновенной, листьев толокнянки обыкновенной и брусники обыкновенной в системе н- бутанол – ледяная уксусная кислота – вода (4:1:2 об/об/об) в присутствии РСО арбутина после обработки раствором диазобензолсульфокислоты. Обозначения: в соответствии с таблицей 4.

Также нами был проведен сравнительный ВЭЖХ-анализ извлечений из побегов черники, листьев толокнянки и брусники. Анализ проводили в градиентном режиме, условия описаны в разделе «Материалы и методы исследования» (рис. 42-44).

Данный метод также может быть использован для оценки подлинности растительного сырья.

арбутин Рисунок 42 – ВЭЖХ-хроматограмма водного извлечения из листьев брусники обыкновенной.

–  –  –

Рисунок 43 – ВЭЖХ-хроматограмма извлечения на 40% этиловом спирте из листьев толокнянки обыкновенной.

Рисунок 44 – ВЭЖХ-хроматограмма извлечения на 40% этиловом спирте из листьев черники обыкновенной.

Известно, что основным действующим компонентом листьев толокнянки и брусники является арбутин (-D-глюкопиранозидом гидрохинона), однако его присутствие маскируется присутствием других соединений, также реагирующих с диазосоединениями. В указанных выше условиях хроматографического разделения (пробоподготовка, объем пробы и т.п.) арбутин в побегах черники обыкновенной не обнаруживается. Так как другие фенольные соединения, представленные в исследуемых видах ЛРС, в основном являются полифенолами (флавоноиды, дубильные вещества и др.), связывающиеся с алюминия оксидом, полученные извлечения нами были профильтрованы через слой алюминия оксида (х.ч., нейтральный II по Брокману, «Реахим») [36].

Извлечения до и после фильтрования через слой алюминия оксида были проанализированы в различных системах растворителей, известных для ТСХанализа арбутина (рис. 45), а также с помощью метода ВЭЖХ в системе 0,01 М КН2РО4, подкисленная Н3РО4 до рН 3,00±0,01, и ацетонитрил (9:1); расход подвижной фазы: 0,6 мл/мин; детекция при 280 нм (рис. 46-48).

Рисунок 45 – Хроматограммы и схемы разделения извлечений из листьев толокнянки, брусники и побегов черники на этиловом спирте 70%до и после твердофазной экстракции в разных системах растворителей: А – подвижная фаза: хлороформ –спирт этиловый 96% (6:4 об/об); Б – подвижная фаза: хлороформ –спирт этиловый 96% – вода (26:16:3 об/об/об); В – подвижная фаза: н-бутанол – ледяная уксусная кислота – вода (4:1:2 об/об/об).

Обозначения:1 – извлечение из листьев толокнянки до фильтрования через слой алюминия оксида; 2 – извлечение из листьев толокнянки после фильтрования через слой алюминия оксида; 3 – извлечение из листьев брусники до фильтрования через слой алюминия оксида; 4 – извлечение из листьев брусники после фильтрования через слой алюминия оксида; 5 – извлечение из побегов черники до фильтрования через слой алюминия оксида; 6 – извлечение из побегов черники после фильтрования через слой алюминия оксида; 7 – государственный стандартный образец арбутина.

–  –  –

Рисунок 46 - ВЭЖХ-хроматограмма извлечения на 40% этиловом спирте из листьев толокнянки обыкновенной после фильтрования через слой алюминия оксида.

арбутин Рисунок 47 - ВЭЖХ-хроматограмма водного извлечения из листьев брусники обыкновенной после фильтрования через слой алюминия оксида.

Рисунок 48 - ВЭЖХ-хроматограмма водного извлечения из побегов черники обыкновенной после фильтрования через слой алюминия оксида.

Из исследуемых хроматографических систем для ТСХ-анализа наибольшей разрешающей способностью по отношению к арбутину и химически родственному соединению обладала подвижная фаза хлороформ – спирт этиловый 96% – вода (26:16:3) (больше 1,0). Оптимальной для разделения этих веществ также являлась система хлороформ – спирт этиловый 96% (6:4) (разрешающая способность примерно равна 0,6).

В извлечении из брусники после фильтрования помимо пятна, соответствующего арбутину, обнаруживается другое пятно с более высоким значением Rf, которое также окрашивается в красный цвет после обработки раствором диазобензолсульфокислоты в красный цвет и предположительно является метиларбутином. Значения Rf анализируемых соединений в различных системах растворителей приведены в таблице 5.

–  –  –

В описанных выше условиях для ВЭЖХ- и ТСХ-анализа арбутин в побегах черники обыкновенной не обнаруживается. Следует отметить, что результаты йодометрического анализа, описанного для количественного определения арбутина в листьях толокнянки и брусники, показывают присутствие этого соединения в побегах черники обыкновенной 2,41%. Однако это может быть объяснено вкладом других сопутствующих соединений.

Фитохимическое исследование плодов черники обыкновенной 4.2.

При хроматографическом разделении на силикагеле (колонка № 1) окрашенные в характерные для антоцианов цвета фракции начинали выходить при содержании в хлороформе 20% этилового спирта, содержащего 0,1% хлористоводородной кислоты. Основная масса антоцианов десорбировалась при элюировании 40% подкисленным этиловым спиртом в хлороформе.

Целевые фракции объединяли и наносили на силикагель, элюировали смесями хлороформ – этиловый спирт, содержащий 0,1% НСl в различных соотношениях при увеличивающейся концентрации спирта. В результате были получены фракции, содержащие преимущественно гликозиды мальвидина и цианидина; фракции, содержащие в основном гликозиды цианидина и дельфинидина и фракции, содержащие преимущественно гликозиды дельфинидина.

Для разделения смеси этих соединений использовали рехроматографию на слое полиамида. Упаренные фракции, содержащие гликозиды мальвидина и цианидина, наносили на полиамид; после того как раствор впитывался в адсорбент, полиамид промывали хлороформом, 20%, 40%, 60% раствором подкисленного метанола в хлороформе и чистым метанолом (содержащим 0,1% НСl). Фракции собирали объемом по 5 мл. При содержании в хлороформе 20% подкисленного метилового спирта выходил в основном мальвидин-3-глюкозид.

Во фракциях, полученных при элюировании 60% раствором метанола в хлороформе и кислым метанолом, находился преимущественно цианидин-3глюкозид.

Очистку фракций, содержащих гликозиды цианидина и дельфинидина, также проводили методом жидкостной колоночной хроматографии на полиамиде аналогично предыдущему. Относительно чистый дельфинидин-3-глюкозид был во фракциях, выходящих при элюировании кислым метанолом (рис. 49).

Чистоту веществ подтверждали методом ТСХ в различных системах растворителей. Полученные фракции, содержащие относительно чистые вещества, оставляли при комнатной температуре открытыми для испарения растворителя.

–  –  –

Рисунок 49 - Схема выделения антоцианов из плодов черники Таким образом, выделены 3 доминирующих антоциана (с Rf – 0,51; 0,36 и 0,20 в системе н-бутанол - ледяная уксусная кислота-вода 4:1:2). Сравнение их химических свойств показало, что первое вещество не изменяло свою окраску при добавлении раствора алюминия хлорида, что было объяснено как отсутствие расположенных в орто-положении друг к другу фенольных гидроксилов, которые обусловили бы комплексообразование (характерно для производных мальвидина).

Второе и третье вещества при добавлении раствора алюминия хлорида приобретали синий цвет.

На основании данных ЯМР- и масс-спектра доминирующего соединения (Rf

- 0,36 в системе н-бутанол - ледяная уксусная кислота-вода 4:1:2), УФ-спектра раствора этого веществ в 1% этанольном растворе хлористоводородной кислоты, выделенное вещество было идентифицировано как цианидин-3-О-глюкозид.

Кривые поглощения выделенных антоцианов имеют характерные максимумы при 281±2 нм и в видимой области. Максимумы поглощения в видимой области несколько отличались. Для вещества с Rf в системе н-бутанол ледяная уксусная кислота-вода (4:1:2) – 0,51-0,52 (мальвидин-3-глюкозиду) максимум поглощения соответствовал 537±2 нм; для вещества с Rf – 0,36 (цианидин-3-глюкозиду) - 544±2 нм; веществу Rf – 0,20 (дельфинидин-3глюкозиду) соответствовала длина волны при максимуме поглощения 551±2 нм.

Соотношение удельных показателей поглощения в видимой и УФ-области для антоцианов и извлечения из плодов составляет 1,5-1,8 (рис. 50).. Максимум поглощения извлечения из плодов черники, полученного настаиванием при температуре 8±2 °С (экстрагент – 95% спирт, содержащий 1% НСl), соответствовал веществу с Rf – 0,36 (546±2 нм), т.е. цианидин-3-О-глюкозиду.

Характерная кривая поглощения может быть использована для качественного анализа изучаемого растительного сырья (табл. 6).

Рисунок 50 – Кривые поглощения выделенных антоцианов. Delph-3-Glc – дельфинидин-3-глюкозид; Cyan-3-Glc – цианидин-3-глюкозид; Malv-3-Glc – мальвидин-3-глюкозид По данным спектров в УФ- и видимой области был определен удельный показатель поглощения цианидин-3-О-глюкозида в глюкозида в 1% растворе хлористоводородной кислоты в 95% этиловом спирте при аналитической длине волны 546 нм (100±4,3) и в 0,5% спиртовом растворе аммиака при аналитической длине волны 623 нм (250±3,6).

Полученные значения удельного показателя поглощения были использованы при разработке методики количественного определения антоцианов в плодах черники.

Фитохимическое исследование побегов черники обыкновенной 4.3.

С целью изучения химического состава побегов черники обыкновенной было получено извлечение на 70% этиловом спирте.



Pages:   || 2 |
Похожие работы:

«Защита и карантин растений УДК 633.5/.9:632.7 НАСЕКОМЫЕ И КЛЕЩИ-ВРЕДИТЕЛИ ТЕХНИЧЕСКИХ И МАСЛИЧНЫХ КУЛЬТУР КАЗАХСТАНА Ж.Д. ИСМУХАМБЕТОВ, академик НАН РК ТОО "Казахский НИИ защиты и карантина растений" e-mail: emi-88@mail.ru Ключевые слова: насекомые, клещи, вредител...»

«СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ НАУКИ УДК 632.4:635.21(470.324) ВРЕДОНОСНОСТЬ АЛЬТЕРНАРИОЗА КАРТОФЕЛЯ КАК ОСНОВНОГО БИОЛОГИЧЕСКОГО РЕСУРСА АГРОЦЕНОЗА ВОРОНЕЖСКОЙ ОБЛАСТИ Елена Сергеевна Мельникова, аспирант кафедры биологии и защиты растений Елизаве...»

«Всероссийская молодёжная научно­практическая конференция "Фундаментальные основы современных аграрных технологий и техники" ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ПОВЫШЕНИЯ СЕМЕННОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО Ю.О. Пономарев, аспирант кафедры агрономии и экологии СГСХА Научный руководитель: Прудникова А.Г., докто...»

«Министерство образования Республики Беларусь Учреждение образования "Белорусский государственный университет информатики и радиоэлектроники" Кафедра экологии Камлач П.В. КОНТРОЛЬ РАДИАЦИОННОЙ ОБСТАНОВКИ НА МЕСТНОСТИ, В ЖИЛЫХ И РАБОЧИХ ПОМЕ...»

«ISSN 0513-1634 Бюллетень ГНБС. 2014. Вып. 110 59 УДК 582.998.16:577.19:631.577 БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ВОДНО-ЭТАНОЛЬНОГО ЭКСТРАКТА ARTEMISIA ABSINTHIUM L. Г.В. КОРНИЛЬЕВ, А.Е. ПАЛИЙ, Л.А. ЛОГВИНЕНКО Никитский ботанический сад, г. Ялта, Республика Крым, РФ Изучен качественный и количественный состав водно-этанольного экстракта...»

«Пояснительная записка Рабочая программа по биологии для 6 класса составлена в соответствии с Федеральным компонентом Государственного стандарта общего образования, одобренным совместным решением коллегии Минобразования России и Президиума РАО от 23.12. 2003 г. № 21/ 12 и утвержденным приказом Минобрнауки РФ от 5.03. 2004 г. № 1089....»

«Учреждение Российской академии наук Институт природных ресурсов, экологии и криологии СО РАН Министерство образования, науки и молодежной политики Забайкальского края Забайкальский государственный гуманитарно-педагогический универси...»

«УДК 57 : 378.4(476-25).096-057.85(03) ББК 28р31(4Беи-2)я2 В92 А в т о р ы: В. В. Лысак, Т. И. Дитченко, В. В. Гричик, И. М. Попиначенко Рекомендовано ученым советом биологического факультета 15 сентября 2010 г., протокол № 1 Рецензент доктор биологических наук, профессор В. М. Юрин Выпускники биологического...»

«СПОРЫ ГРИБОВ: ПОКОЙ, ПРОРАСТАНИЕ, ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И ЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ БИОТЕХНОЛОГИИ (ОБЗОР) © 2012 г. Е. П. Феофилова*, А. А. Ивашечкин**, А. И. Алёхин***, Я. Э. Сергеева* *Институт...»

«RU 2 399 204 C2 (19) (11) (13) РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ (51) МПК A01M 21/00 (2006.01) ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ, ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ (12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ (21), (22) Заявка:...»

«АКАДЕЛ,\ИЯ НАУК СССР УРАЛЬСКИй НАУЧНЫй ЦЕНТР ИНТРОДУКЦИЯ И АККЛИМАТИЗАЦИЯ ДЕКОРАТИВНЫХ РАСТЕНИЙ С В Е Р Д Л О В С К. 19 8 2 УдК 581.582+595.70+635.91.92 Интродукция и акклиматизация декоративных растений: [Сб. статей]. Сверд;ювск: УНЦ АН СССР, 1982. Сборник содержит матери...»

«1. Цель освоения дисциплины Основной целью освоения дисциплины "Земледелие"является формирование представлений, знаний и профессиональных навыков по научным и технологическим основам современного земледелия.В процессе изучениядисциплины "Земледелие"решаются следующие задачи: научные основы земледелия; агрофиз...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РГАУ МСХА-им. К.А.Тимирязева институт природообустройства им. А.Н.Костякова И.В. ГЛАЗУНОВА, В....»

«Березовиков Н.Н., Губин Б.М., Гуль И.Р., Ерохов С.Н., Карпов Ф.Ф., Коваленко А.В. Птицы пустыни Таукумы (юго-восточный Казахстан). Киев-Львов, 1999. – 117 стр. оригинал-макет; после печати –...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "САРАТОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.Г. ЧЕРНЫШЕВСКОГО" Кафедра уголовного, экологического права...»

«КИРЕЕВА ГАЛИНА СЕРГЕЕВНА ВНУТРИБРЮШИННОЕ ХИМИОПЕРФУЗИОННОЕ ЛЕЧЕНИЕ ДИССЕМИНИРОВАННОГО РАКА ЯИЧНИКА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Специальность: 14.01.12 онкология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор медицинских наук В.Г. Беспалов Санкт-Петербург ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК...»

«Образовательное учреждение высшего образования Тверской институт экологии и права Кафедра Финансов и менеджмента РАБОЧАЯ ПРОГРАММА УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ (МОДУЛЯ) СТАТИСТИКА 080100.62 "Экономика" Направление подготовки Профиль подготовки "Финансы и кредит" Квалификация (степени) выпускника Бакалавр Тверь, 2014 Содержание Орган...»

«Дуплицкая Елена Анатольевна ЭКОНОМИЧЕСКОЕ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ РАЗМЕЩЕНИЯ И УСТРОЙСТВА ТЕРРИТОРИИ ЯГОДНИКОВ (НА ПРИМЕРЕ МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 08.00.05 – Экономика и управление народным хозяйством (землеустройство) Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата экономических наук Моск...»

«РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ПРИРОДНЫХ РЕСУРСОВ, ЭКОЛОГИИ И КРИОЛОГИИ RUSSIAN ACADEMY OF SCIENCES SIBERIAN BRANCH INSTITUTE OF NATURAL RESOURCES, ECOLOGY AND CRYOLOGY M.S. Novikova ECONOMIC AND GEOGRAPHICAL FEATURES OF T...»

«БОРОВОЙ МИХАИЛ ВАСИЛЬЕВИЧ БОЛЕЗНИ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ И ПРИЕМЫ ЗАЩИТЫ ОТ НИХ ПРИ ПОЧВОЗАЩИТНОЙ ТЕХНОЛОГИИ ВОЗДЕЛЫВАНИЯ В УСЛОВИЯХ ЦЕНТРАЛЬНОГО ЧЕРНОЗЕМЬЯ Специальность: 06.01.07 – защита растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Воронеж – 2011 г. Пожалуйста, зарегистри...»

«Геоэкология ЧЕРНЫЕ ЗЕМЛИ КАЛМЫКИИ: КОМПЛЕКСНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И РАЗРАБОТКА ГИС Ташнинова Людмила Николаевна, кандидат биологических наук Институт аридных зон Южного научного центра РАН 358000, Российская Федерация, Республика Калмыкия...»

«Песяк Сергей Владимирович ФОТОМОРФОГЕНЕЗ ARTEMISIA ANNUA L. IN VITRO. 03.01.05 — физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Красноярск – 2012 1    Работа выполнена в ФГБОУ ВПО "Национальный исследовательский Томский государственный университет" Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Карначук Раиса Александровн...»

«Научно-исследовательская работа "Влияние запахов на кратковременную память человека"Выполнила: Татарченко Екатерина Алексеевна учащаяся 9 "В" класса, МБОУ "Школа №80" г. Ростова-на-Дону Руководитель: Воронова Наталья Викторовна, учитель биологии МБОУ "Школа №80" г. Ростова-на-Дону, к.б.н...»

«ISSN 2072-0920 Новые технологии. 2009. №3 УДК 631. 811: 631.445.41 (470.621) ББК 40.40 (2 Ады) Т-24 Тах Ирина Петровна, кандидат биологических наук, доцент кафедры землеустройства факультета аграрных технологий Майкопского государстве...»

«РЕЗЮМЕ К СТАТЬЯМ №3 ЗА 2015 ГОД УДК 597.442 ДИНАМИКА ПОПУЛЯЦИЙ БЕЛУГИ, РУССКОГО ОСЕТРА И СЕВРЮГИ В УСЛОВИЯХ ЗАПРЕТА ИХ КОММЕРЧЕСКОГО ЛОВА В ВОЛГО-КАСПИЙСКОМ БАССЕЙНЕ © 2015 г. Г. И. Рубан, Р. П. Ходоревская*, М. И. Шатуновский Институт проблем экологии и эволюции им. А. Н. Северцова РАН, Москва,...»

«Справочник КООС. Приложение VI к Протоколу Приложение VI к Протоколу по охране окружающей среды к Договору об Антарктике Материальная ответственность, возникающая в результате чрезвычайных экологических ситуаций Преамбула Стороны, Признавая значение предотвращения, минимизации и ограничения масштабов воз...»

«Жеребцова Светлана Николаевна Воспитатель МКДОУ №207, город Киров Описание опыта работы "Формирование начал экологической культуры у детей дошкольного возраста посредством дидактических...»








 
2017 www.doc.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные документы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.